转基因的产生<em&gt;水润</em&gt;通过胚胎显微注射

摘要

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

摘要

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

引言

水润已用于研究再生，格局的形成，以及干细胞大约有250岁² 水润有由三个细胞系一个简单的身体构造:外胚层上皮，内胚层上皮，间质。所述管状体由外胚层和内胚层上皮细胞系，其中每一个是单电池层而形成的。所有的上皮细胞在体内的列是有丝分裂。当上皮细胞被移动到末端^3，头部（嘴和触须）在的反口端的口端部或支脚（基底光盘），它们阻止在细胞周期的G2期和改变细胞命运^4。间质细胞系的细胞位于上皮细胞之间的间隙内。此系由多能干细胞存在于身体塔⁵的外胚层上皮细胞层的支持。间质干细胞产生3躯体大公升型（神经，腺体细胞，nematocytes）和生殖细胞^6,7。

由于刺丝胞动物门中的一员，该姐妹团所有两侧对称， 水润可以在多细胞动物中共享的基本生物过程揭示。直到最近，这些努力受到缺乏可靠的方法对基因功能的扰动阻碍。然而，随着转基因方法¹的发展，我们现在能够采取水润充分利用，以更好地了解常见的多细胞动物，例如干细胞的功能，再生和构图的基本机制。转基因水润线通过注射的质粒DNA导入胚胎，这导致随机整合和表达嵌合在刚孵化的主要频率的确定。在一个特定的血统与统一表达式A线可通过无性繁殖来确定。以无性繁殖transg的能力ENIC 水润线是在大多数动物模型，这只能通过有性生殖传播的优点。此外，转基因细胞可以容易地在活体内由于动物的透明度和缺乏内源性荧光蛋白⁸的跟踪。

在由于第一转基因水润线七年作了^1，如线已被用于各种各样的应用。在不同类型的细胞的荧光蛋白的表达使得有可能跟踪细胞运动，观察变化，细胞形态，并且追踪细胞命运都在野生型的条件和化学扰动^1,5,9-12之后。此外，不同的荧光蛋白在各种细胞系表达允许特定细胞群的FAC​​S分离。这种技术已被用于干细胞特异性的mRNA和谱系特异性小RNA ^13,14测序。而启动子两水润肌动蛋白基因之一得到了最广泛的应用，一些细胞类型特异性启动子已经确定，并用于驱动绿色荧光蛋白的表达在转基因水润 ^{9,11,15,16。}在未来，细胞类型特异性启动子将允许对任何特定的细胞类型的观测和收集。此外，转基因的方法已成功地用于定义WNT3子¹⁷的顺式作用调节元件。

转基因方法水润的发展提供了强有力的方法来通过异位表达，表达和击倒测试基因的功能。转基因动物已表达荧光标记的蛋白，以检查这两个功能和细胞定位^18-20。此外，RNA发夹的绿色荧光蛋白转基因的3'UTR的表达导致靶基因^21,22击倒。在这些方法中的GFP是必需的，以确定并创立了转基因株系的追踪期间的转基因组织。但是，很可能在一些情况下，绿色荧光蛋白分子会干扰标记的蛋白质的功能。最近的研究表明， 水螅基因可以被布置在一个操纵子结构， 即，多顺反子转录物制成，然后由反式剪接前导另外分离和分开²³翻译。通过将编码蛋白质或操纵子和荧光蛋白基因的下游位置的上游位置的RNA发夹的基因，可以追踪转基因组织，而无需标签编码的蛋白质或RNA发夹的基因。此方法已被用于表达与的DsRed2的操纵子结构的RNA发夹结构，以实现基因敲低^14。

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研究方案

1，制备质粒DNA，针头和注射的菜

1. 准备使用高速马克西和Midi试剂盒的质粒DNA，并收集DNA，以2.5毫克/毫升用乙醇沉淀。将DNA沉淀应溶解于无核酸酶的去离子水。存储在10-20微升等份的DNA于-20℃。 （可用矢量列表，请参阅补充表1）
2. 用琼脂糖构建一个低谷举行的胚胎在100×15毫米的培养皿使注射的菜。
   1. 将一个75×50显微镜载玻片成100×15毫米的培养皿以一定的角度。倒入约50ml的2％的琼脂糖熔化水润介质²⁴到培养皿中。或者，先倒入琼脂糖入菜，并飘起了"显微注射模具的鱼"在上面。
   2. 经过琼脂糖凝固，取出载玻片或模具。如果使用载玻片上，切掉多余的琼脂糖用剃刀BLA德成墙。 水润凝中等入菜，并立即使用它，或它在4℃保存备用。注意:如果储存在4℃下使用之间注射菜肴可重复使用。
3. 拉从高硼硅玻璃毛细管针，灯丝使用下列条件的微量拉马:加热525，拉75，速度100，时间50商店针按成泥的狭长地带在培养皿中，使他们手持平行于培养皿的底部。
4. 制备注射溶液，结合3微升2.5毫克/毫升的质粒DNA溶液与2微升10％酚红。涡旋该溶液，随后又旋转它10分钟，在最大速度下在微量离心以除去可能堵塞针的任何颗粒。
5. 在解剖显微镜下，夹针从尖端几毫米用钳子来创建一个小口。注意:在打开的适当大小有一定的灵活性荷兰国际集团，因为压力可以在步骤3.3进行调整，以适应这种变化。
6. 放置在培养皿，以便它保持在针与所述尖端向下的竖直位置。由液体吸取入针的后端装入大约0.5微升注射溶液的针。允许毛细管作用拉动溶液进针的尖端。

2，准备胚胎注射

1. 每天扫描息肉产蛋水润 AEP的菌种。收集这些息肉和将它们搁置在一个单独的培养皿。白天观察这些息肉每隔几个小时监测卵形成的进展。当鸡蛋突破外胚层和坐在缩回 ​​外胚层细胞环，他们已经准备好注射^25。把这些息肉有几个水润有睾丸注射，以便受精前至少1小时的菜。 水润</ em>的雄性将精子释放没有任何特殊的操作。
2. 如果女性被发现在AEP菌落与完全成形的鸡蛋，这是大约400微米的直径^25，或1至8细胞期胚胎中，也收集这些用于注射。立即注入已经开始切割胚胎。注意:这是不可能的，告诉完全成形的鸡蛋和单细胞受精卵的区别，因而这些应孵育注射前男性。
3. 注射前，除去大部分的亲组织的上方和下方用手术刀以＃15刀片的胚胎。只留下胚胎用一小片体柱的附着，所使用，如果必要的操纵胚胎用钳子。注意:被解剖远离胚胎将重新生成，并应保存，以确保女性保持水润群体的组织。
4. 使用巴斯德吸管，将胚胎注入培养皿，安排它们平行的壁琼脂糖低谷。

3，显微注射质粒DNA的

1. 安装在磁性底座，坐在铁板的微量。装入注射保持器，其是保持在针上的控制杆显微操作的微量的一部分。安装操纵杆操纵到铁板上，带有磁性的立场。放置在右侧解剖显微镜的这整个设置和注射夹持位置，以使得它是在观察视野中可见。
2. 将注入培养皿用解剖显微镜下的胚胎，定向成使得琼脂糖槽的垂直壁是到左边。将针头插入注射座，降低针尖入菜的水润媒体。
3. 慢慢转动顺时针方向注射器的旋钮，直到矿物油填充针和注射液源源不断的顶部观察退出针头插入液联中等。如果流过强，转动旋钮，逆时针降低压力。实行此步骤，以定期获得合适的压力，这取决于针开口的尺寸（ 即，注射针是如何被修剪的步骤1.5）。注意:如果流太强，胚胎不会注入生存。
4. 同时，通过解剖显微镜观察，将注入培养皿，使得第一胚胎是在视场的中心。移动针，以便它正在触摸的胚胎。用显微刺穿用针胚胎。注意:在琼脂糖槽的垂直壁将保持胚胎从一旁通过​​针推。
5. 使注射液流入胚胎1或2秒，然后迅速取出针。如果胚胎中有多个小区，分别注入各小区。使用镊子重新定向胚胎对准下一个单元与针的尖端。
6. 第一安莉芳后o为喷射，移动盘，使下胚胎是在注射位置，并重复该过程;继续下去，直到所有的胚胎被注入。

4，培养和胚胎孵化

1. 将所有注入胚胎与几个水润有睾丸一盘（这是为了确保所有的胚胎受精）。孵化的胚胎在18℃培养箱中培养，而他们继续胚胎。
2. 一旦角质层阶段为止，将各注入胚胎到一个24孔板中填充有水润介质的单个井。
3. 孵育注入胚2周在黑暗中在18℃。
4. 在2周潜伏期后，检查解剖显微镜下每个注射胚胎。注意，在其中角质层期胚胎已经从小块父母组织的分离的和亲本组织已再生的任何情况。立即删除该再生性息肉，使其不英里staken一个新的幼体。
5. 移动注射胚胎的菜下水族灯在室温。每天检查板和收集幼体。新的幼体将白色的，因为水润息肉的典型的粉红色的颜色来自于他们所吃的丰年 。
6. 观察荧光显微镜下的幼体来检测转基因表达。

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结果

建立转基因水润线

饲料的转基因幼体，每2-3天用卤虫无节幼体 。稚龟孵出有时后不要吃了两天。一些新的幼体永远不会吃的，因此将无法生存。如果幼体是转基因无论是在外胚层（ 图1A）或内胚层上皮组织，让动物芽和收集有最转基因组织（ 图1B，C）的花蕾。继续与新的芽为此，直至转基因系建立与转基因中任一的外胚层（ 图1D）<...

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讨论

水润常规无性繁殖，但需要环境刺激，开始产生配子。这些刺激是不明确定义为最水润物种可能与应变的应变。 à显著障碍产生转基因水润的是获得定期的胚胎，因为它可能很难在实验室环境诱导水润成为性。 AEP的菌株^25，但是，产生配子容易在实验室中，这是已经被使用至今用于制备转基因品系的唯一菌株。用于诱导配子生产中最常用的方法是通过饮食操纵?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151