Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

Riepilogo

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduzione

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni ² Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell'epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità ^3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fase G2 del ciclo cellulare e cambiate destino cellulare ^4. Le cellule della linea interstiziale risiedono negli interstizi tra le cellule epiteliali. Questa linea è sostenuta da cellule staminali multipotenti che si trovano nello strato epiteliale ectodermica della colonna corpo ^5. Le cellule staminali interstiziali danno origine a tre cel somaticaTipi L (nervi, cellule della ghiandola, e nematocytes) e le cellule germinali ^6,7.

Come membro del phylum Cnidari, il gruppo sorella a tutti bilaterians, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali multicellulari. Fino a poco tempo, questi sforzi sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi affidabili per la perturbazione della funzione del gene. Tuttavia, con lo sviluppo della metodologia transgenica ^1, siamo ora in grado di sfruttare appieno Hydra per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di base comuni ad animali pluricellulari, come ad esempio la funzione delle cellule staminali, la rigenerazione, e patterning. Linee transgeniche Hydra sono stabiliti mediante iniezione di DNA plasmidico in embrioni, che si traduce in integrazione casuale ed espressione chimerico in frequenza sostanziale di larve. Una linea con l'espressione uniforme in un particolare lignaggio può essere stabilita per propagazione asessuata. La capacità di propagare clonale transgENIC Hydra righe è un vantaggio rispetto alla maggior parte dei modelli animali, che possono essere propagate solo da riproduzione sessuale. Inoltre, cellule transgeniche possono essere seguiti facilmente in vivo a causa della trasparenza dell'animale e l'assenza di proteine ​​fluorescenti endogene ^8.

Nei sette anni dalla prima linea Hydra transgeniche sono state effettuate ^1, tali linee sono stati utilizzati per una varietà di applicazioni. Espressione di proteine ​​fluorescenti in diversi tipi di cellule ha permesso di monitorare il movimento delle cellule, osservare cambiamenti di forma delle cellule, e tenere traccia destini cellulari sia in condizioni di tipo selvatico e dopo perturbazione chimica ^1,5,9-12. Inoltre, l'espressione di proteine ​​fluorescenti differenti nelle diverse linee consente FACS isolamento di specifiche popolazioni cellulari. Questa tecnica è stata utilizzata per la sequenza di mRNA specifici di cellule staminali e le specifiche del lineage piccoli RNA ^13,14. Mentre il promotore diuno dei due geni di actina Hydra è stato più utilizzato, a poche cellule di tipo promotori specifici sono stati identificati e utilizzati per guidare l'espressione di GFP in transgenici Hydra ^9,11,15,16. In futuro, i promotori specifici delle cellule di tipo permetteranno l'osservazione e la raccolta di qualsiasi tipo di cellula specifico. Inoltre, un approccio transgenico è stato usato con successo per definire cis-agenti elementi regolatori del promotore Wnt3 ^17.

Lo sviluppo di metodi transgenici in Hydra fornisce un valido approccio per testare la funzione dei geni dall'espressione ectopica, sovraespressione, e atterramento. Gli animali transgenici sono stati fatti che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato, al fine di esaminare sia la funzione e la localizzazione cellulare ^18-20. Inoltre, l'espressione di forcine RNA nel 3'UTR di un transgene GFP conduce atterramento di geni bersaglio ^21,22. In questi approcci è necessaria GFP per identificaree monitorare il tessuto transgenico durante la creazione della linea transgenica. Tuttavia, è probabile che in alcuni casi la molecola GFP potrebbe interferire con la funzione della proteina tag. Uno studio recente dimostra che i geni Hydra possono essere organizzati in una configurazione operone, cioè, trascrizioni policistronici sono fatti, che vengono poi separati da trans-impiombato Inoltre leader e tradotto separatamente ^23. Inserendo un gene codificante una proteina o una forcina RNA nella posizione a monte di un operone e un gene della proteina fluorescente nella posizione a valle, si può tracciare tessuto transgenico senza dover codificare il gene codificante la proteina o RNA hairpin. Questo metodo è stato utilizzato per esprimere un tornante RNA in una configurazione operone con DsRed2 al fine di raggiungere gene knockdown ^14.

Protocollo

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione

1. Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili)
2. Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm.
   1. Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm Petri in un angolo. Versare circa 50 ml di 2% agarosio sciolto in Hydra medio ²⁴ nella piastra di Petri. In alternativa, versare l'agarosio nel piatto prima e galleggiare un "Microiniezione pesce Mold" in alto.
   2. Dopo l'agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino o lo stampo. Se è stato utilizzato un vetrino, tagliare via l'eccesso di agarosio con un bla rasoiode per formare un muro. Versare Hydra media nel piatto e utilizzare immediatamente o conservarlo a 4 ° C fino al momento dell'uso. Nota: i piatti iniezione possono essere riutilizzati se conservato a 4 ° C tra usi.
3. Tirare aghi da capillari in vetro borosilicato con un filamento sul estrattore micropipetta con le seguenti condizioni: scaldare 525, tirare 75, velocità 100, tempo 50. Conservare gli aghi di loro premendo in una stretta striscia di argilla in una capsula di Petri tale che siano tenuto parallelo al fondo del piatto.
4. Per preparare la soluzione iniettabile, combinare 3 ml di / soluzione di DNA plasmidico ml 2,5 mg con 2 ml di 10% di rosso fenolo. Vortex la soluzione brevemente e poi girare per 10 min alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero intasare l'ago.
5. Sotto un microscopio da dissezione, agganciare l'ago a pochi millimetri dalla punta con una pinza per creare una piccola apertura. Nota: Vi è una certa flessibilità nella dimensione appropriata del apertozione perché la pressione può essere regolata nel passaggio 3.3 per accogliere questa variazione.
6. Porre la capsula di Petri in modo che sta tenendo l'ago in posizione verticale con la punta verso il basso. Caricare l'ago con circa 0,5 ml di soluzione iniettabile pipettando liquido nell'estremità posteriore dell'ago. Lasciare azione capillare per tirare la soluzione nella punta dell'ago.

2 Preparazione di embrioni per iniezione

1. Su base giornaliera eseguire la scansione della cultura ceppo Hydra AEP per polipi producono uova. Raccogliere questi polipi e metterli da parte in un piatto di cultura separata. Osservare questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l'andamento della formazione dell'uovo. Quando le uova si rompono attraverso l'ectoderma e si siedono su un anello di cellule ectodermiche retratti sono pronti per l'iniezione ^25. Posizionare questi polipi in un piatto con diversi Hydra che hanno testicoli per almeno 1 ora prima dell'iniezione per consentire la fecondazione. Hydra </ Em> maschi rilascerà spermatozoi senza alcuna manipolazione speciale.
2. Se le femmine si trovano nella colonia AEP con uova completamente formate, che sono circa 400 micron di diametro ^25, o da 1 a 8 celle embrioni stadio, raccogliere anche questi per l'iniezione. Iniettare immediatamente gli embrioni che hanno iniziato scissione. Nota: Non è possibile capire la differenza tra le uova completamente formate e zigoti unicellulari, quindi questi devono essere incubate con i maschi prima dell'iniezione.
3. Prima dell'iniezione, rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto l'embrione utilizzando un bisturi con lama # 15. Lasciare solo l'embrione con un piccolo pezzo di colonna corpo attaccato, da utilizzare per manipolare l'embrione con una pinza se necessario. Nota: Il tessuto che viene sezionato dalla embrione si rigenera e dovrebbe essere salvato per garantire che le femmine rimangono nella colonia di Hydra.
4. Usando una pipetta Pasteur, spostare embrioni al piatto di iniezione, disponendole parallele alla parete dellaattraverso agarosio.

3. Microiniezione di DNA plasmidi

1. Montare il microinjector su un supporto magnetico che si siede su una lastra di ferro. Montare il supporto di iniezione, che è la parte del microinjector che contiene l'ago, su un micromanipolatore joystick. Montare il manipolatore joystick per la piastra di ferro, con un supporto magnetico. Posizionare questo intero set-up sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto di iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione.
2. Porre la capsula iniezione con embrioni al microscopio da dissezione, orientato in modo tale che la parete verticale della vasca agarosio è a sinistra. Inserire l'ago nel supporto di iniezione e abbassare la punta dell'ago nel mezzo Hydra nel piatto.
3. Ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino olio minerale riempie la parte superiore dell'ago e un flusso continuo di soluzione iniettabile si osserva uscire l'ago nel Hydrun mezzo. Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Pratica questo passo per ottenere ordinariamente una pressione adeguata, che dipende dalle dimensioni dell'apertura dell'ago (cioè, come l'ago è stato fermato nella fase 1.5). Nota: Se il flusso è troppo forte, l'embrione non sopravviverà l'iniezione.
4. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, spostare il piatto iniezione, in modo che il primo embrione è al centro del campo. Spostare l'ago in modo che sia a contatto con quella dell'embrione. Utilizzare il micromanipolatore per perforare l'embrione con l'ago. Nota: La parete verticale della vasca agarosio manterrà l'embrione di essere messo da parte dal ago.
5. Lasciare che la soluzione iniettabile di fluire in embrione 1 o 2 secondi e poi rimuovere l'ago rapidamente. Se l'embrione ha più di una cella, iniettare ogni cella singolarmente. Usare pinze per riorientare l'embrione per allineare la cella successiva con la punta dell'ago.
6. Dopo il primo Embryo viene iniettato, spostare il piatto in modo che la prossima embrione è nella posizione di iniezione e ripetere la procedura; continuare fino a quando sono state iniettate tutti gli embrioni.

4. coltura e cova di embrioni

1. Spostare tutti gli embrioni iniettati in un piatto con un paio di Hydra che hanno testicoli (questo è quello di garantire che tutti gli embrioni sono fecondati). Incubare gli embrioni in un 18 ° C incubatore mentre continuano embriogenesi.
2. Una volta raggiunta la fase della cuticola, spostare ogni embrione iniettato ad un pozzo individuale di una piastra da 24 pozzetti riempiti con Hydra medie.
3. Incubare gli embrioni iniettati per 2 settimane al buio a 18 ° C.
4. Dopo il periodo di incubazione 2 settimane, controllare ogni embrione iniettato sotto il microscopio da dissezione. Nota casi in cui l'embrione cuticola stadio ha staccati dal piccolo pezzo di tessuto parentale e il tessuto dei genitori ha rigenerati. Rimuovere questo polipo rigenerato immediatamente in modo che non è mistaken per un nuovo cucciolo.
5. Spostare il piatto di embrioni iniettati sotto una luce acquario a temperatura ambiente. Controllare le piastre ogni giorno e raccogliere larve. Le nuove larve saranno bianco perché il tipico colore rosa di polipi Hydra nasce dalla Artemia di cui si nutrono.
6. Osservare i piccoli sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l'espressione del transgene.

Risultati

Stabilire linee transgeniche Hydra

Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all'animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C).<...

Discussione

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l'ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP ^25, tuttavia, produce ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151