Geração de Transgênicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinjeção de embriões

Resumo

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Resumo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introdução

Hydra foi usado para estudar a regeneração, formação de padrões, e as células-tronco para cerca de 250 anos ² Hydra tem um plano corporal simples, que consiste de três linhagens de células:. Epitelial ectodérmica, endodérmica epitelial e intersticial. O corpo tubular é formado por o ectodérmico e linhagens epiteliais da endoderme, cada um dos quais é uma camada única de células. Todas as células epiteliais no corpo da coluna são mitótico. Quando as células epiteliais são deslocados para as extremidades ^3, a cabeça (boca e tentáculos) na extremidade bucal ou do pé (disco basal) na extremidade aboral, eles prendem na fase G2 do ciclo celular e alterar o destino da célula ^4. As células da linhagem intersticial residem dentro dos interstícios entre as células epiteliais. Esta linhagem é apoiada por células-tronco multipotentes que estão localizados na camada epitelial ectodérmica da coluna corpo ^5. As células estaminais intersticiais dar origem a três cel somáticatipos l (nervos, células glandulares, e nematocytes) e as células germinativas ^6,7.

Como um membro do filo Cnidaria, o grupo irmão de todos os bilaterians, Hydra pode lançar luz sobre os processos biológicos fundamentais compartilhados entre os animais multicelulares. Até recentemente, esses esforços foram impedidos pela falta de métodos confiáveis ​​para a perturbação da função dos genes. No entanto, com o desenvolvimento de metodologia transgênico ^1, somos agora capazes de tirar o máximo proveito de Hydra para obter uma melhor compreensão dos mecanismos básicos comuns a animais multicelulares, como a função de células-tronco, regeneração e padronização. Linhas Transgénicas Hydra são estabelecidos por injecção de plasmídeo de ADN em embriões, o que resulta na integração aleatória e expressão quimérico com uma frequência significativa de filhotes. Uma linha com expressão uniforme numa linhagem particular pode ser estabelecida por propagação vegetativa. A capacidade de propagar clonalmente transgenic Hidra linhas é uma vantagem sobre a maioria dos modelos de animais, que pode ser propagado somente por reprodução sexuada. Além disso, as células transgénicas podem ser facilmente rastreados in vivo, devido à transparência do animal e a ausência de proteínas fluorescentes endógenos ^8.

Nos sete anos desde as primeiras linhas Hydra transgênicas foram feitas ^1, essas linhas foram usados ​​para uma variedade de aplicações. Expressão de proteínas fluorescentes em diferentes tipos de células tornou possível controlar o movimento celular, observar as alterações na forma da célula, e rastrear destinos celulares, tanto em condições de tipo selvagem e depois perturbação química ^1,5,9-12. Além disso, a expressão de proteínas fluorescentes diferentes nas diversas linhagens de FACS permite o isolamento de populações de células específicas. Esta técnica tem sido utilizada para o seqüenciamento de mRNAs específicos de células-tronco e de linhagem específica pequenos RNAs ^13,14. Enquanto o promotor deum dos dois genes da actina Hidra tem sido mais amplamente utilizado, a poucos tipos de células-promotores específicos foram identificados e utilizados para dirigir a expressão da GFP em Hydra ^9,11,15,16 transgénico. No futuro, os promotores específicos do tipo de célula irá permitir a observação e recolha de qualquer tipo de célula específico. Além disso, uma abordagem transgénica foi utilizado com sucesso para definir os elementos reguladores que actuam em cis do promotor Wnt3 ^17.

O desenvolvimento de métodos transgênicos em Hydra oferece uma abordagem robusta para testar a função dos genes pela expressão ectópica, superexpressão e knockdown. Os animais transgénicos que foram feitos expressar as proteínas marcadas com fluorescência, de modo a examinar tanto a função e localização celular ^{de 18-20.} Além disso, a expressão de ARN de gancho de cabelo na 3'UTR de um transgene GFP leva a knockdown de genes alvo ^21,22. Nessas abordagens GFP é necessário para identificare rastrear o tecido transgénico durante a criação da linha transgénica. No entanto, é provável que, em alguns casos, a molécula GFP iria interferir com a função da proteína etiquetada. Um estudo recente demonstra que os genes Hydra podem ser dispostas numa configuração operão, por exemplo, transcrições policistrónico são feitos, os quais são então separados por adição líder trans-splicing e traduzidos em separado ^23. Ao colocar um gene que codifica uma proteína ou um gancho de cabelo de ARN na posição a montante de um operão e um gene de proteína fluorescente na posição de jusante, pode-se controlar o tecido transgénico sem ter que marcar o gene que codifica a proteína ou RNA hairpin. Este método tem sido utilizado para expressar um gancho de cabelo de ARN de um operão com DsRed2 configuração, a fim de alcançar gene knockdown ^14.

Protocolo

1 Preparação de plasmídeo de DNA, agulhas e injeção Pratos

1. Prepare o DNA de plasmídeo utilizando um kit de alta velocidade ou Maxi Midi e concentra-se o ADN para 2,5 mg / ml usando a precipitação com etanol. O sedimento de DNA deve ser dissolvido em água livre de nuclease desionizada. Armazenar o ADN em 10-20 mL alíquotas a -20 ° C. (Ver Quadro Suplementar 1 para uma lista de vetores disponíveis)
2. Faça um prato de injeção utilizando agarose para construir uma calha para a realização de embriões em uma placa de Petri de 100 x 15 mm.
   1. Coloque uma lâmina de microscópio de vidro de 75 x 50 em um 100 x 15 mm numa caixa de Petri com um ângulo. Despeje a cerca de 50 ml de 2% de agarose em forma derretida Hidra ²⁴ para a placa de Petri. Alternativamente, despeje a agarose para o prato primeiro e flutuar um "molde microinjeção Fish" no topo.
   2. Após o ágar ter solidificado, remover a lâmina de vidro, ou o molde. Se foi usada uma lâmina de vidro, corte o excesso de agarose com um bla navalhade formar uma parede. Despeje meio Hydra no prato e usá-lo imediatamente ou armazená-lo a 4 ° C até ser necessário. Nota: pratos de injecção pode ser reutilizado se for armazenado a 4 ° C entre as utilizações.
3. Puxar agulhas capilares de vidro de borossilicato com um filamento no puxador de micropipeta usando as seguintes condições: 525 aquecer, puxar 75, a velocidade de 100, o tempo da loja 50. as agulhas, pressionando-os para uma estreita faixa de argila, em uma placa de Petri de tal modo que eles são mantida paralelamente ao fundo do prato.
4. Para preparar a solução para injecção, combinar 3 uL de solução de ADN de plasmídeo de 2,5 mg / mL com 2 mL de 10% de vermelho de fenol. Vortex a solução brevemente e em seguida girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga para remover quaisquer partículas que podem entupir a agulha.
5. Sob um microscópio de dissecação, o clipe de agulha alguns milímetros da ponta com uma pinça para criar uma pequena abertura. Nota: Existe uma certa flexibilidade no tamanho adequado do abertoing porque a pressão pode ser ajustada na etapa 3.3 para acomodar esta variação.
6. Colocar a placa de Petri de modo a que é segura a agulha na posição vertical, com a ponta para baixo. Coloque a agulha com cerca de 0,5 ml de solução de injecção por pipetagem do líquido para dentro da extremidade posterior da agulha. Permitir uma acção capilar para puxar a solução para dentro da ponta da agulha.

2 Preparação de embriões para Injeção

1. Em uma base diária digitalizar a cultura tensão Hydra AEP para pólipos produtoras de ovos. Colete estes pólipos e retirá-las em um prato de cultura independente. Observe estes pólipos cada poucas horas durante o dia para monitorar o progresso de formação do ovo. Quando os ovos quebram através do ectoderma e sentar-se em um anel de células ectodérmicas retraídos eles estão prontos para a injeção ^25. Colocar estes pólipos em um prato com vários hidra que têm testículos durante pelo menos 1 hora antes da injecção para permitir a fertilização. Hidra </ Em> machos vai liberar esperma sem qualquer manipulação especial.
2. Se as fêmeas são encontrados na colónia AEP com ovos completamente formados, que são aproximadamente de 400 um de diâmetro ^{de 25,} ou de 1 a 8, embriões nos estágios de células, também recolher estes injectável. Injetar imediatamente embriões que começaram clivagem. Nota: Não é possível dizer a diferença entre os ovos totalmente formadas e zigotos unicelulares, portanto, estes devem ser incubadas com os homens antes da injeção.
3. Antes da injecção, remover a maior parte do tecido parental acima e abaixo do embrião utilizando um bisturi, com uma lâmina de # 15. Deixar apenas o embrião com um pequeno pedaço de coluna corpo ligado, para ser utilizada para manipular o embrião com uma pinça, se necessário. Nota: O tecido que é dissecado a partir do embrião irá regenerar e deve ser guardada para assegurar que permanecem fêmeas na colónia Hidra.
4. Utilizando uma pipeta de Pasteur, mover os embriões para o prato de injecção, dispondo-os em paralelo à parede docalha de agarose.

3. microinjecção de ADN do plasmídeo

1. Monte o microinjetor em um suporte magnético que fica em uma chapa de ferro. Montar o suporte da injecção, que é a parte da microinjector que prende a agulha, em um micromanipulador joystick. Monte o manipulador joystick para a chapa de ferro, com um suporte magnético. Coloque esta todo o conjunto para cima no lado direito de um microscópio de dissecção e posiciona o porta-injecção de modo que seja visível no campo de observação.
2. Coloque o prato de injecção com embriões sob o microscópio de dissecação, orientada de tal modo que a parede vertical da calha de agarose é para a esquerda. Inserir a agulha no suporte de injecção e diminuir a ponta da agulha para o meio de Hidra no prato.
3. Lentamente, rodar o botão da seringa na direcção dos ponteiros do relógio até que o óleo mineral preenche a parte superior da agulha e um fluxo constante de solução de injecção é observado sai da agulha no hidrum meio. Se o fluxo é muito forte, diminuir a pressão, girando o botão para a esquerda. Praticar este passo para obter rotineiramente uma pressão adequada, o que depende do tamanho da abertura da agulha (ou seja, a forma como a agulha foi cortado no passo 1.5). Nota: Se a corrente é muito forte, o embrião não irá sobreviver a injeção.
4. Durante a visualização através de um microscópio de dissecação, movimentar o prato de injecção de modo a que o primeiro embrião está no centro do campo. Mover a agulha de modo que ela está a tocar que embrião. Usar o micromanipulador para perfurar o embrião com a agulha. Nota: A parede vertical da calha agarose vai manter o embrião do que está sendo deixado de lado pela agulha.
5. Permitir que a solução de injeção a fluir para o embrião 1 ou 2 segundos e, em seguida, remover a agulha rapidamente. Se o embrião tem mais de uma célula, injectar cada célula individual. Use uma pinça para reorientar o embrião para alinhar a célula seguinte, com a ponta da agulha.
6. Após o primeiro embryo é injectado, movimentar o prato de modo a que o lado do embrião está na posição de injecção e repetir o procedimento; continuar até que todos os embriões foram injectados.

4 A cultura ea eclosão dos embriões

1. Mover todos os embriões injectados em um prato com algumas hidra que têm testículos (isto é para assegurar que todos os embriões são fertilizados). Incubar os embriões em um 18 ° C incubadora, enquanto eles continuam a embriogênese.
2. Uma vez que a fase de cutícula é atingido, mover cada embrião injectado para um poço individual de uma placa de 24 poços cheios com meio de hidra.
3. Incubar os embriões injectados durante 2 semanas no escuro a 18 ° C.
4. Após o período de incubação duas semanas, verifique cada embrião injetado sob o microscópio de dissecação. Observe quaisquer casos em que o embrião cutícula estágio se soltou do pequeno pedaço de tecido parental eo tecido dos pais tenha regenerado. Remover este pólipo regenerado imediatamente para que ele não é mistaken de um novo filhote.
5. Mova o prato de embriões injetados sob a luz do aquário à temperatura ambiente. Verifique as placas de cada dia e recolher filhotes. Novos filhotes será branco porque a cor-de-rosa típico de pólipos Hydra vem da Artemia eles comem.
6. Observe os filhotes debaixo de um microscópio de fluorescência para detectar a expressão do transgene.

Resultados

Estabelecer linhas de Hydra transgênicos

Alimentar filhotes transgênicas a cada 2-3 dias com náuplios de Artemia. Os filhotes, por vezes, não comer por um ou dois dias após a eclosão. Alguns novos filhotes nunca vai comer, e, portanto, não vai sobreviver. Se o filhote é transgénicos quer na ectodérmica (Figura 1A) ou o tecido epitelial endodérmica, permitir que o animal a germinar e recolher as gemas que têm a maioria dos tecidos transgénicos

Discussão

Hydra rotineiramente reproduz de forma assexuada, mas requer estímulos ambientais para começar gametas produtores. Esses estímulos não são bem definidos para a maioria das espécies de Hydra e podem variar de estirpe para estirpe. Um obstáculo significativo para a produção de Hidra transgénico é a obtenção de embriões numa base regular porque pode ser difícil num ambiente laboratorial para induzir a tornar-se Hydra sexual. A estirpe AEP ^25, no entanto, produz ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151