Generación de transgénicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinyección de embriones

Resumen

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Resumen

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introducción

Hydra se ha utilizado para estudiar la regeneración, la formación de patrones, y las células madre para unos 250 años ² Hydra tiene un plan de cuerpo simple que consiste en tres linajes celulares:. Epitelio ectodérmico, endodérmico epitelial y intersticial. El cuerpo tubular está formado por la ectodérmico y endodérmico linajes epiteliales, cada uno de los cuales es una sola capa de células. Todas las células epiteliales en la columna de la carrocería son mitótico. Cuando las células epiteliales se desplazan en las extremidades ^3, la cabeza (boca y tentáculos) en el extremo oral o el pie (disco basal) en el extremo aboral, que detención en la fase G2 del ciclo celular y cambiar el destino celular ^4. Las células del linaje intersticial residen dentro de los intersticios entre las células epiteliales. Este linaje es apoyado por las células madre multipotentes que se encuentran en la capa epitelial ectodérmica de la columna de cuerpo ^5. Las células madre intersticiales dan lugar a tres cel somáticatipos l (nervios, células de la glándula, y nematocytes) y las células germinales ^6,7.

Como miembro del filo Cnidaria, el grupo hermano de todos los bilaterales, Hydra puede arrojar luz sobre los procesos biológicos fundamentales compartidos entre los animales multicelulares. Hasta hace poco, estos esfuerzos fueron obstaculizados por la falta de métodos fiables para la perturbación de la función génica. Sin embargo, con el desarrollo de la metodología transgénico ^1, ahora somos capaces de sacar el máximo provecho de Hydra para obtener una mejor comprensión de los mecanismos básicos comunes a los animales multicelulares, como la función de células madre, la regeneración y el patrón. Líneas transgénicas Hydra son establecidos por inyección de plásmido de ADN en embriones, lo que resulta en la integración aleatoria y de expresión quimérico en una frecuencia sustancial de las crías. Una línea con expresión uniforme en un linaje particular puede ser establecida por la propagación asexual. La capacidad de propagar clonalmente transgENIC Hydra líneas es una ventaja sobre la mayoría de los modelos animales, que puede ser propagada sólo por reproducción sexual. Además, las células transgénicas se pueden rastrear fácilmente in vivo debido a la transparencia del animal y la ausencia de proteínas fluorescentes endógenos ^8.

En los siete años transcurridos desde las primeras líneas transgénicas Hydra fueron hechas ^1, dichas líneas se han utilizado para una variedad de aplicaciones. La expresión de proteínas fluorescentes en diferentes tipos de células ha permitido rastrear el movimiento celular, observar los cambios en la forma de la célula, y la pista destino celular, tanto en condiciones de tipo salvaje y después de la perturbación química ^1,5,9-12. Además, la expresión de diferentes proteínas fluorescentes en los diversos linajes permite el aislamiento de FACS de poblaciones celulares específicas. Esta técnica ha sido utilizada para la secuenciación de ARNm específicos de células madre y linaje específico de pequeños RNAs ^13,14. Mientras que el promotor deuno de los dos genes de actina Hydra se ha utilizado más ampliamente, unos pocos de tipo celular promotores específicos han sido identificados y se utiliza para controlar la expresión de GFP en transgénicos Hydra ^9,11,15,16. En el futuro, promotores específicos de tipo celular permitirá para la observación y la recogida de cualquier tipo de célula específico. Además, un enfoque transgénico se utilizó con éxito para definir los elementos reguladores que actúan en cis del promotor Wnt3 ^17.

El desarrollo de métodos transgénicos en Hydra proporciona un enfoque robusto para probar la función de los genes por la expresión ectópica, la sobreexpresión, y caída. Los animales transgénicos se han hecho que expresan proteínas fluorescentemente marcadas con el fin de examinar la función y localización celular ^18-20. Además, la expresión de ARN horquillas en el 3'UTR de un transgén GFP lleva a desmontables de genes diana ^21,22. En estos enfoques se requiere para identificar las buenas prácticas agrariasy rastrear el tejido transgénico durante la creación de la línea transgénica. Sin embargo, es probable que en algunos casos la molécula de GFP podría interferir con la función de la proteína etiquetada. Un estudio reciente demuestra que los genes Hydra pueden ser dispuestos en una configuración operón, es decir, se hacen polycistronic transcripciones, que luego son separados por trans-empalmados Además líder y traducido por separado ^23. Mediante la colocación de un gen que codifica una proteína o un ARN de horquilla en la posición aguas arriba de un operón y un gen de proteína fluorescente en la posición aguas abajo, se puede realizar un seguimiento de tejido transgénico sin tener que etiquetar el gen que codifica la proteína o ARN de horquilla. Este método se ha utilizado para expresar una horquilla de ARN en una configuración operón con DsRed2 a fin de lograr gen desmontables ^14.

Protocolo

1 Preparación de ADN plásmido, agujas, y platos de inyección

1. Preparar el ADN de plásmido usando un kit Maxi de alta velocidad o Midi y se concentra el ADN a 2,5 mg / ml utilizando la precipitación con etanol. El sedimento de ADN se debe disolver en agua desionizada libre de nucleasa. Almacene el ADN en 10-20 alícuotas a -20 ° C. (Véase el cuadro 1 complementario para obtener una lista de vectores disponibles)
2. Hacer un plato de inyección utilizando agarosa para construir un canal para la celebración de los embriones en una placa de 100 x 15 mm de Petri.
   1. Colocar un portaobjetos de microscopio de vidrio 75 x 50 en una placa de 100 x 15 mm Petri en un ángulo. Vierta aproximadamente 50 ml de 2% de agarosa fundido en un medio de Hydra ²⁴ en la placa de Petri. Alternativamente, se vierte la agarosa en el plato primero y flotar un "Mold Microinyección Fish" en la parte superior.
   2. Después de la agarosa se ha solidificado, retirar el portaobjetos de vidrio o el molde. Si se ha utilizado un portaobjetos de vidrio, cortar el exceso de agarosa con un bla de afeitarde para formar una pared. Verter medio Hydra en el plato y utilizar inmediatamente o almacenarlo a 4 ° C hasta que se necesite. Nota: los platos de inyección pueden ser reutilizados si se almacenan a 4 ° C entre usos.
3. Tire las agujas de capilares de vidrio borosilicato con un filamento en el extractor de micropipeta usando las siguientes condiciones: calor 525, tire 75, velocidad 100, tiempo 50. Tienda las agujas de comprimirlos en una estrecha franja de tierra batida en un plato de Petri de manera que sean mantenida en paralelo a la parte inferior del plato.
4. Para preparar la solución de inyección, combinar 3 l de solución de ADN de plásmido de 2,5 mg / ml con 2 l de 10% de fenol rojo. Vortex la solución brevemente y luego girar por 10 min a velocidad máxima en una microcentrífuga para eliminar las partículas que pueden obstruir la aguja.
5. Bajo un microscopio de disección, corte la aguja unos pocos milímetros de la punta con fórceps para crear una pequeña abertura. Nota: Hay una cierta flexibilidad en el tamaño adecuado de la aperturaing porque la presión se puede ajustar en el paso 3.3 para acomodar esta variación.
6. Coloque la placa de Petri de modo que se mantiene la aguja en una posición vertical con la punta hacia abajo. Cargar la aguja con aproximadamente 0,5 l de solución de inyección con la pipeta el líquido en el extremo posterior de la aguja. Permitir que la acción capilar para tirar de la solución en la punta de la aguja.

2 Preparación de embriones para inyección

1. Sobre una base diaria escanear el cultivo de la cepa Hydra AEP para los pólipos producen huevos. Reunir estos pólipos y déjelos a un lado en una placa de cultivo separado. Observar estos pólipos cada pocas horas durante el día para controlar el progreso de la formación del huevo. Cuando los huevos se rompen a través del ectodermo y se sientan en un anillo de células ectodérmicas retraídos que están listos para inyección ^25. Coloque estos pólipos en un plato con varios Hydra que tienen testículos durante al menos 1 hora antes de la inyección para permitir la fertilización. Hydra </ Em> machos lanzará esperma sin ninguna manipulación especial.
2. Si las hembras se encuentran en la colonia AEP con los huevos completamente formados, que son aproximadamente 400 micras de diámetro ^25, o de 1 a embriones en estadio de 8 células, también recoger estos para inyección. Inmediatamente inyectar embriones que han comenzado escisión. Nota: No es posible establecer la diferencia entre los huevos completamente formadas y cigotos unicelulares, por lo tanto estas deben ser incubadas con los machos antes de la inyección.
3. Antes de la inyección, eliminar la mayor parte del tejido parental encima y por debajo del embrión usando un escalpelo con una cuchilla # 15. Dejar sólo el embrión con un pequeño trozo de la columna cuerpo adjunto, que se utiliza para manipular el embrión con pinzas si es necesario. Nota: El tejido que se diseca lejos del embrión regenerará y debe ser guardado para asegurar que las mujeres permanecen en la colonia Hydra.
4. Utilizando una pipeta Pasteur, mover el plato de embriones para inyección, disponiéndolos en paralelo a la pared de laa través de agarosa.

3. microinyección de ADN plásmido

1. Monte el microinyector en un soporte magnético que se sienta en una placa de hierro. Montar el soporte de inyección, que es la parte de la microinyector que mantiene la aguja, en un micromanipulador joystick. Monte el manipulador joystick a la plancha de hierro, con un soporte magnético. Coloque esta todo el conjunto-en el lado derecho de un microscopio de disección y colocar el soporte de inyección de modo que sea visible en el campo de observación.
2. Coloque el plato de la inyección con embriones bajo el microscopio de disección, orientada de tal manera que la pared vertical de la cubeta de agarosa está a la izquierda. Insertar la aguja en el soporte de inyección y bajar la punta de la aguja en el medio Hydra en el plato.
3. Girar lentamente el pomo de la jeringa en la dirección de las agujas del reloj hasta que el aceite mineral se llena la parte superior de la aguja y un flujo constante de solución de inyección se observa que sale de la aguja en el hidrun medio. Si la corriente es demasiado fuerte, reduzca la presión girando la perilla a la izquierda. Practicar este paso para obtener de forma rutinaria una presión adecuada, que depende del tamaño de la abertura de la aguja (es decir, cómo se recorta la aguja en el paso 1.5). Nota: Si la corriente es demasiado fuerte, el embrión no sobrevivió a la inyección.
4. Mientras observa a través del microscopio de disección, mover el plato de inyección de manera que el primer embrión está en el centro del campo. Mover la aguja de modo que está en contacto con ese embrión. Utilice el micromanipulador para perforar el embrión con la aguja. Nota: La pared vertical de la cubeta de agarosa mantendrá el embrión sea empujado a un lado por la aguja.
5. Deje que la solución inyectable fluya hacia el embrión 1 o 2 segundos y luego retire la aguja rápidamente. Si el embrión tiene más de una celda, inyectar cada célula individual. El uso de fórceps para reorientar el embrión para alinear la siguiente celda con la punta de la aguja.
6. Después de la primera embryse inyecta o, mover el plato para que la próxima embrión se encuentra en la posición de inyección y repita el procedimiento; continuará hasta que se hayan inyectado todos los embriones.

4. El cultivo y la eclosión de embriones

1. Mover todos los embriones inyectados en un plato con algunos Hydra que tienen testículos (esto es para asegurar que todos los embriones son fertilizados). Incubar los embriones en una incubadora a 18 °, mientras continúan la embriogénesis.
2. Una vez que se alcanza la etapa de cutícula, mover cada embrión inyectado a un pozo individual de una placa de 24 pocillos con medio lleno Hydra.
3. Incubar los embriones inyectados durante 2 semanas en la oscuridad a 18 ° C.
4. Después del periodo de incubación de 2 semana, comprobar cada embrión inyectado bajo la lupa. Tenga en cuenta los casos en los que el embrión cutícula etapa ha desprendido de la pequeña muestra de tejido de los padres y el tejido de los padres ha regeneradas. Eliminar este pólipo regenerado inmediatamente de modo que no es mistaken de una nueva cría.
5. Mueva el plato de embriones inyectados bajo una luz del acuario a RT. Compruebe los platos cada día y recoger las crías. Nuevas crías serán blancas porque el típico color rosa de pólipos Hydra viene de la Artemia que comen.
6. Observar las crías bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la expresión del transgén.

Resultados

El establecimiento de líneas transgénicas de Hydra

Alimente las crías transgénicas cada 2-3 días con nauplios de Artemia. Las crías a veces no comen por un día o dos después de la eclosión. Algunas de las nuevas crías nunca van a comer, y por lo tanto no va a sobrevivir. Si la cría es transgénica ya sea en el ectodérmica (Figura 1A) o tejido epitelial endodérmico, permitir que el animal brote y recoger los brotes que tienen el tejido más transg?...

Discusión

Hydra reproduce asexualmente rutinariamente, pero requiere de estímulos ambientales para comenzar gametos productores. Estos estímulos no están bien definidas-para la mayoría de las especies Hydra y pueden diferir de cepa a cepa. Un obstáculo significativo a la producción de transgénicos Hydra es la obtención de embriones sobre una base regular, ya que puede resultar difícil en un entorno de laboratorio para inducir Hydra para convertirse sexual. La cepa AEP ^25, si...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151