Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

Zusammenfassung

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Zusammenfassung

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Einleitung

Hydra ist verwendet worden, um die Regeneration, Musterbildung zu studieren, und Stammzellen für etwa 250 Jahre ² Hydra hat eine einfache Körperplan, bestehend aus drei Zelllinien. Ektodermalen Epithelzellen, endodermalen Epithelzellen und interstitiellen. Der rohrförmige Körper wird von der ektodermalen und endodermalen Epithelzellen Abstammungslinien, von denen jede eine einzelne Zellschicht ausgebildet ist. Alle epithelialen Zellen im Körper Spalte mitotischen. Wenn Epithelzellen in den Extremitäten ³ verschoben wird, der Kopf (Mund und Tentakeln) in der mündlichen Ende oder dem Fuß (basal Scheibe) an der aboralen Ende, sie in der G2-Phase des Zellzyklus zu arretieren, und ändern Sie das Schicksal der Zelle ^4. Die Zellen der Zwischenlinie liegen in den Zwischenräumen zwischen den Epithelzellen. Diese Linie wird von multipotenten Stammzellen, die in der ektodermalen Epithelschicht des Körpers Spalte ⁵ angeordnet werden unterstützt. Die interstitielle Stammzellen führen zu drei somatische cell Typen (Nerven, Drüsenzellen, und nematocytes) und die Keimzellen ^6,7.

Als Mitglied des Stammes Cnidaria, die Schwestergruppe zu allen Bilateria, Hydra Licht auf grundlegende biologische Prozesse unter vielzelligen Tiere geteilt vergießen. Bis vor kurzem waren diese Bemühungen durch das Fehlen zuverlässiger Verfahren zur Störung der Gen-Funktion behindert. Doch mit der Entwicklung transgener Methodik ^1, sind wir jetzt in der Lage, alle Vorteile der Hydra zu ergreifen, um ein besseres Verständnis der grundlegenden Mechanismen gemeinsam vielzelligen Tiere, wie der Stammzellfunktion, Regeneration und Strukturierung zu gewinnen. Transgene Hydra Linien werden durch Injektion von Plasmid-DNA in Embryonen, die in zufälliger Integration und chimären Ausdruck in einem wesentlichen Häufigkeit der Jungtiere führt gegründet. Eine Linie mit gleichmäßiger Expression in einem bestimmten Abstammungslinie kann durch asexuelle Vermehrung festgestellt werden. Die Fähigkeit, klonal transg propagierenENIC Hydra Linien ist ein Vorteil gegenüber der Mehrzahl von Tiermodellen, die nur durch sexuelle Reproduktion vermehrt werden können. Darüber hinaus können transgene Zellen in vivo leicht aufgrund der Transparenz des Tieres und der Abwesenheit von endogener Fluoreszenzproteine ^​​8 verfolgt werden.

In den sieben Jahren seit der ersten transgenen Hydra Linien wurden ¹ wie Linien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Expression von fluoreszierenden Proteinen in verschiedenen Zelltypen hat es möglich gemacht, um die Zellbewegung zu verfolgen, Änderungen in der Zellform zu beobachten und zu verfolgen Zellschicksale sowohl in Wildtyp-Bedingungen und nach der chemischen Störung ^1,5,9-12. Darüber hinaus ermöglicht die FACS Isolierung von spezifischen Zellpopulationen, die Expression von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen in den verschiedenen Linien. Diese Technik wurde für die Sequenzierung von Stammzell-spezifischen mRNAs und linienspezifische kleinen RNAs ^13,14 eingesetzt. Während der Promotoreiner der beiden Hydra Aktin Gene wurde am häufigsten verwendet wird, eine spezifische Promo wenige Zelltyp wurden identifiziert und verwendet, um die Expression von GFP bei transgenen Hydra ^9,11,15,16 fahren. In Zukunft werden Zelltyp-spezifische Promotoren für die Beobachtung und Erfassung von spezifischen Zelltyp ermöglichen. Darüber hinaus wurde eine transgene Ansatz erfolgreich verwendet, um die cis-wirkenden regulatorischen Elemente des Promotors Wnt3 ¹⁷ definieren.

Die Entwicklung transgener Methoden in Hydra bietet eine robuste Ansatz zum Testen der Funktion von Genen durch ektopische Expression, Überexpression und Knockdown. Transgenen Tieren vorgenommen wurden, die fluoreszenzmarkierte Proteine, um die Funktion und zelluläre Lokalisation ^18-20 untersuchen auszudrücken. Zusätzlich wurde die Expression von RNA-Haarnadeln in der 3'UTR des GFP-Transgens führt zu Knockdown von Zielgenen ^21,22. In diesen Ansätzen GFP ist erforderlich, um zu ermittelnund verfolgen die transgene Gewebe während der Erstellung der transgenen Linie. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass in einigen Fällen das GFP-Molekül würde mit der Funktion des markierten Proteins stören. Eine neuere Untersuchung zeigt, dass Hydra-Gene in einem Operon-Konfiguration angeordnet, das heißt, polycistronische Transkripte hergestellt, die dann durch Transspleißprodukte Führer zusätzlich getrennt und separat ²³ übersetzt werden. Mit der Abgabe eines Gens, das ein Protein oder eine RNA-Haarnadel in die Position stromaufwärts von einem Operon und ein fluoreszierendes Protein-Gen in der stromabwärtigen Position kodiert, kann eine transgene Gewebe, ohne den das Protein-oder RNA-Haarnadel-kodierende Gen Schiene. Diese Methode wurde verwendet, um eine RNA-Haarnadel in einem Operon Konfiguration mit DsRed2 um zu erreichen Gen-Knockdown ¹⁴ auszudrücken.

Protokoll

1. Herstellung von Plasmid-DNA, Nadeln und Injektions Geschirr

1. Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit einem High-Speed-Maxi oder Midi-Kit und konzentrieren die DNA auf 2,5 mg / ml mit Ethanol-Fällung. Das DNA-Pellet sollte in Nuklease-freiem deionisiertem Wasser gelöst werden. Speichern die DNA in 10-20 ul-Aliquots bei -20 ° C. (Siehe Zusatz Tabelle 1 für eine Liste der verfügbaren Vektoren)
2. Machen Sie eine Spritz Gericht unter Verwendung von Agarose, eine Mulde zur Aufnahme Embryonen in einem 100 x 15 mm Petrischale konstruieren.
   1. Legen Sie ein 75 x 50 Glasobjektträger in einen 100 x 15 mm Petrischale in einem Winkel. Pour ca. 50 ml 2% Agarose in Hydra Medium ²⁴ in die Petrischale aufgeschmolzen. Alternativ gießen Sie die Agarose in die Schüssel erste und Schwimmer eine "Mikroinjektion Fisch Mold" an der Spitze.
   2. Nach Erstarren der Agarose, entfernen Sie den Glasobjektträger oder der Form. Wenn ein Glasobjektträger verwendet wurde, schneiden Sie das überschüssige Agarose mit einem Rasiermesser blade, um eine Wand zu bilden. Gießen Hydra Medium in die Schüssel und verwenden Sie es sofort oder lagern Sie es bei 4 ° C, bis sie benötigt. Hinweis: Injektions Geschirr kann wiederverwendet werden, wenn bei 4 ° C zwischen den Verwendungen gespeichert.
3. Ziehen Nadeln aus Borosilikatglas Kapillaren mit einem Faden auf der Mikropipette Puller mit den folgenden Bedingungen: Hitze 525, ziehen 75, Geschwindigkeit 100, Zeit 50. Speichern Sie die Nadeln durch Drücken sie in einem schmalen Streifen von Ton in einer Petrischale, so dass sie Hand parallel zum Boden der Schale.
4. Zur Herstellung der Injektionslösung, kombiniert 3 ul 2,5 mg / ml Plasmid-DNA-Lösung mit 2 ul 10% Phenolrot. Vortex die Lösung kurz und dann drehen Sie es für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikro um alle Partikel, die die Nadel verstopfen könnten, zu entfernen.
5. Unter einem Binokular, Clip der Nadel ein paar Millimeter von der Spitze mit einer Pinzette, eine kleine Öffnung zu schaffen. Anmerkung: Es ist eine gewisse Flexibilität in der geeigneten Größe der offenening, weil der Druck in Schritt 3.3 eingestellt, um diese Variation zu berücksichtigen.
6. Legen Sie die Petrischale, so dass es hält die Nadel in einer vertikalen Position mit der Spitze nach unten. Laden der Nadel mit etwa 0,5 ul Injektionslösung durch Pipettieren der Flüssigkeit in das hintere Ende der Nadel. Ermöglichen Kapillarwirkung, um die Lösung in die Spitze der Nadel zu ziehen.

2. Herstellung von Embryonen zur Injektion

1. Täglich scannen die Hydra AEP Stammkultur für Polypen, deren Eier. Sammeln Sie diese Polypen und legen Sie sie beiseite in einem separaten Kulturschale. Alle paar Stunden zu beobachten diese Polypen im Laufe des Tages, um den Fortschritt des Eierbildung zu überwachen. Wenn Eier durchbrechen die Ektoderm und sitzen auf einem Ring aus eingefahrenen ektodermalen Zellen sind sie bereit für die Injektion ^25. Legen Sie diese Polypen in einer Schale mit mehreren Hydra, die Hoden für mindestens 1 Stunde vor der Injektion, um die Befruchtung zu ermöglichen. Hydra </ Em> Männchen Spermien ohne besondere Manipulation freizugeben.
2. Wenn Frauen sind in der AEP-Kolonie mit voll gebildet Eier, die etwa 400 um im Durchmesser ^25, oder 1 bis 8-Zell-Stadium Embryonen gefunden werden, sammeln diese auch zur Injektion. Sofort injizieren Embryonen, die Spaltung begonnen haben. Anmerkung: Es ist nicht möglich, die Differenz zwischen den vollständig geformten Eiern und Zygoten Einzeller sagen, so sollten diese bei Männern vor der Injektion inkubiert.
3. Vor der Injektion verringert sich die Eltern Gewebe oberhalb und unterhalb des Embryos unter Verwendung eines Skalpells mit einer # 15 Klinge. Lassen Sie nur den Embryo mit einem kleinen Stück von Körpersäule befestigt ist, zu verwenden, um den Embryo mit einer Pinzette ggf. zu manipulieren. Hinweis: Das Gewebe, aus dem Embryo zerlegt wird regeneriert und sollte gespeichert, um sicherzustellen, dass Frauen in der Hydra-Kolonie verbleiben.
4. Mit einer Pasteurpipette, bewegen Embryonen zur Einspritz Gericht, ordnet sie parallel zur Wand desAgarose Trog.

3. Mikroinjektion von Plasmid-DNA

1. Montieren Sie die Mikroinjektor auf einem Magnetständer, die auf einer Eisenplatte sitzt. Montieren der Einspritzhalterung, die den Teil der Mikroinjektor, dass die Nadel hält, an einer Joystick-Mikromanipulator ist. Montieren Sie den Joystick Manipulator an der Eisenplatte, mit einem Magnetständer. Dieses gesamte Set-up auf der rechten Seite von einem Binokular und Positionierung des Injektionshalters, so dass er im Beobachtungsfeld sichtbar ist.
2. Platzieren des Einspritzform mit Embryonen unter dem Präpariermikroskop ausgerichtet, daß die vertikale Wand der Agarose Trog nach links. Legen Sie die Nadel in die Injektionshalter und senken Sie die Spitze der Nadel in die Hydra Medium in der Schale.
3. Drehen Sie den Knopf der Spritze im Uhrzeigersinn, bis Mineralöl die Spitze der Nadel und einem stetigen Strom von Injektionslösung füllt beobachtet Verlassen der Nadel in die Hydrein Medium. Wenn der Strom zu stark ist, senken Sie den Druck durch Drehen des Knopfes gegen den Uhrzeigersinn. Praxis dieser Schritt auf einen geeigneten Druck, der auf die Größe der Nadelöffnung (dh wie die Nadel in Schritt 1.5 abgeschnitten) hängt routinemßig erhalten. Hinweis: Wenn der Strom zu stark ist, wird der Embryo die Injektion nicht überleben.
4. Schauen Sie durch den Binokular, bewegen Sie den Einspritzschale, so dass der erste Embryo ist in der Mitte des Feldes. Bewegen Sie die Nadel, so dass es zu berühren, dass die Embryos. Verwenden Sie den Mikromanipulator, den Embryo mit der Nadel zu durchstechen. Anmerkung: Die senkrechte Wand der Rinne Agarose wird der Embryo ist von der Nadel beiseite gedrückt halten.
5. Ermöglichen die Injektionslösung in den Embryo 1 oder 2 s fließen und dann schnell die Nadel entfernen. Wenn der Embryo mehr als eine Zelle, wobei jede Zelle individuell zu injizieren. Zange verwenden, um den Embryo neu auszurichten, um die nächste Zelle mit der Spitze der Nadel auszurichten.
6. Nach dem ersten embryo eingespritzt wird, bewegen Sie den Spiegel so, dass die nächste Embryo ist in der Einspritzposition und wiederholen Sie den Vorgang; fortgesetzt, bis alle Embryonen injiziert wurden.

4. Die Züchtung von Embryonen und Brut

1. Bewegen aller injizierten Embryonen in eine Schale mit einigen Hydra, die Hoden haben (dies ist zu gewährleisten, dass alle Embryonen befruchtet). Die Embryonen inkubieren in einer 18 ° C-Inkubator der Embryogenese, während sie weiter.
2. Sobald die Nagelhaut Stadium erreicht ist, bewegen jeden Embryo injiziert, um eine individuelle Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hydra Medium gefüllt ist.
3. Die injizierten Embryonen für 2 Wochen im Dunkeln inkubieren bei 18 ° C.
4. Nach der 2 Wochen Inkubationszeit, überprüfen Sie jeden Embryo injiziert unter dem Binokular. Beachten Sie alle Fälle, in denen die Nagelhaut-Stufen-Embryo aus dem kleinen Stück der elterlichen Gewebe abgelöst und das Eltern Gewebe regeneriert hat. Entfernen Sie diese regeneriert Polypen sofort, so dass es nicht miStaken für ein neues Jungtier.
5. Bewegen Sie den Teller des injizierten Embryonen unter einem Aquarium Licht bei RT. Überprüfen Sie die Platten jeden Tag und sammeln Jungtiere. Neue Jungtiere werden weiß, weil die typische rosa Farbe der Hydra-Polypen kommt von der Artemia sie essen.
6. Beachten Sie die Jungtiere unter einem Fluoreszenzmikroskop zu Transgen-Expression zu erkennen.

Ergebnisse

Gründung transgenen Linien Hydra

Jungtiere ernähren transgenen alle 2-3 Tage mit Artemia-Nauplien. Jungtiere manchmal nicht für ein oder zwei Tage zu essen nach dem Schlüpfen. Einige neue Jungtiere nie zu essen, und damit wird nicht überleben. Wenn das Jungtier ist entweder in der transgenen ektodermalen (Abbildung 1A) oder endodermalen Epithel, damit das Tier zu knospen und sammeln die Knospen, die den meisten transgenen Gewebe (Abbildung 1B, C)....

Diskussion

Hydra routinemäßig reproduziert ungeschlechtlich, erfordert aber Umweltreize zu produzieren Gameten zu beginnen. Diese Stimuli werden für die meisten Arten Hydra gut definiert und kann von Stamm zu Stamm unterscheiden. Ein wesentliches Hindernis für die Herstellung von transgenen Hydra Erhalten Embryonen regelmäßig, weil es schwierig im Labor zu induzieren Hydra sexuelle geworden sein kann. Der AEP-Stamm ²⁵ erzeugt jedoch Gameten leicht im Labor und dies ist der einzi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEP Hydra Strain			Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151