التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

Summary

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Abstract

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introduction

الكلى أمر ضروري لتوازن السوائل، وتنظيم ضغط الدم وتنقية النفايات من الجسم. على الرغم من الثدييات قادرة على إصلاح النيفرون القائمة بعد الإصابة باستخدام الخلايا الظهارية متباينة ^1-4، ويبدو أنها تفتقر إلى مجموعة من الخلايا الجذعية المحجوزة ⁵ وغير قادر على تشكيل النيفرون جديدة من جديد. وعلى النقيض من الثدييات والأسماك الكبار قادرون على تشكيل النيفرون جديدة في جميع أنحاء حياة الكبار لدعم نمو الأسماك وردا على إصابة ^6،7. الزرد، دانيو rerio، هو كائن نموذجا لا تقدر بثمن لدراسة الجهاز تجديد ^10/08 وديه القدرة على تقديم رؤى قوية في طلبات الحصول على هندسة إصلاح كلى الانسان. وقد تبين التحوير ¹¹ لتسمية مجموعة من الخلايا كليون السلف في الكلى الزرد الكبار ^12، ولكن آليات السيطرة على رد lhx1a + الخلايا لإصابة ص: تيراغرام (EGFP Lhx1a)emain غير واضح.

وجنتاميسين أمينوغليكوزيد هو مضاد حيوي يستخدم على نطاق واسع مع الآثار المعروفة كلى والسامة في البشر ^13. حقن داخل الصفاق من الجنتاميسين هو طريقة المتبعة في إحداث إصابات الكلى الحادة في الأسماك ^6. هذه الاصابة في يحاكي الأسماك فقدان خلايا الطلائية وتندب من الكبيبات التي تحدث في البشر بعد جنتاميسين جرعة زائدة من ^14. حمل إصابة في الزرد عن طريق الحقن الجنتاميسين هو وسيلة مريحة للحمل لذلك، متزامن استجابة قوية تجديد، مع العديد من النيفرون الجديدة المنتجة والشروع في وقت واحد من خلال مراحل تشكيل وانتشار والتمايز.

هذا البروتوكول تفاصيل لدينا وسيلة لإصابة قوية وقابلة للتكرار في الزرد الكلى الكبار من خلال الاستفادة من عملية الفرز البصرية موسع للحد من القيم المتطرفة. علينا أن نستفيد من حقيقة أن إصابة مع الجنتاميسين يؤدي إلى موت الأنسجة الظهارية الكلى وشكلأيون من القوالب أنبوبي كلوي، والتي ثم تتراكم في الجماهير في القنوات الكلوة الجنينية الموسطة ومجرور. يتم تمرير هذه من الأسماك ويمكن ملاحظتها بالعين المجردة في الماء. وهذا يسمح لنا للكشف عن الأسماك مع إصابة غير قاتلة قوية، والتي يمكن بعد ذلك تجميعها لمزيد من التجارب. التقليل من أعداد الأسماك لم يصب أو الأسماك التي تموت قبل أن تصل إلى نقطة النهاية من التجربة يؤدي إلى أكثر اتساقا وكفاءة جمع البيانات وتحليلها. بالإضافة إلى ذلك، ليس هناك حاجة لأجهزة خاصة أو الكواشف، مما يجعل فعالية من حيث التكلفة هذه الطريقة ومناسبة للاستخدام في الأوساط الأكاديمية والتعليمية. باستخدام طريقة لدينا، ونحن هنا تظهر آثار زيادة جرعة جنتاميسين على تجديد الكلى، فضلا عن تأثير ارتفاع درجات الحرارة.

Protocol

بيان الأخلاق: ملاحظة: تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية مستشفى ماساتشوستس العام للاستخدام الحيواني في مجال البحوث.

1. إعداد المسبق

1. تحديد عدد البالغين الزرد 6-12 شهرا لإصابة. خطة لتصيب 10-20٪ أكثر من الأسماك وستكون هناك حاجة. من أجل تقليل التباين والعمر استخدام مطابقة الأسماك الشقيق تربيتها معا في نفس الخزان بحيث تكون تقريبا بنفس الحجم ويكون التباين أقل الجيني. الأسماك الإناث هي أسهل بكثير لحقن بالمقارنة مع ذكور السمك، ويرجع ذلك إلى سعة أكبر من البطن. ومع ذلك، من الذكور والإناث تعطي نتائج مماثلة.
2. عندما تفعل هذه التجربة للمرة الأولى، رسم منحنى الجرعة لتحديد الجرعة المناسبة جنتاميسين لسلالة معينة من الأسماك. اختبار كل دفعة جديدة من الجنتاميسين قبل استخدامها في التجارب منذ نقاء جنتاميسين يختلف من دفعة لدفعة واحدة. وينبغي تحديد الجرعة المناسبة من خلال تقييم expressiعلى علامات الإصابة مثل lhx1a. (انظر الشكل 1A - D).
3. يعد حل الجنتاميسين. يمكن تخزين محلول المخزون الجنتاميسين في -20 ° C وإذابة لاستخدامها لاحقا. على سبيل المثال، للحصول على 80 ملغ / كغ جرعة (80 ملغ جنتاميسين / كجم من وزن الجسم) في سمكة وزنها 0.5 غرام، وإعداد 2 ملغ / مل الجنتاميسين في الفوسفات مخزنة المالحة كحل عمل مريحة. هذا يوفر 20 ميكرولتر من الجنتاميسين للحقن داخل الصفاق في الأسماك.
   ملاحظة: بشكل عام، 80-120 ملغ / كغ تحقيق نتائج جيدة، ولكن جرعات منخفضة تصل إلى 40 ملغ / كغ قد يكون مناسبا. جنتاميسين كما يمكن شراؤها في حل للحد من التعرض للخطر لموظفي المختبر.
   ملاحظة: جنتاميسين في الجرعات العالية يمكن أن تكون سامة. ارتداء قفازات وقناع عندما يزن مسحوق.
4. إعداد 100 مل من 0.016٪ من المياه تريكين عن التخدير الأسماك. إعداد الأسهم 25X من تريكين (4 جم / 1 L) الذائب في الماء المعقم milliQ التكيف مع درجة الحموضة 7 وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تمييع 4 ملتر في 100 مل من الماء الأسماك لتركيز العمل من 0.016٪.
   ملاحظة: تريكين هو مخدر والجلد مهيجة، وارتداء القفازات عند التعامل مع.
5. جعل السمك مغرفة من نقل الماصة البلاستيكية عن طريق خفض لمبة في شكل مغرفة وقطع +2 فتحات في أسفل لتصريف المياه. المحاقن تحميل 1ML (مع 10 التدرج ميكرولتر) مع الحل الجنتاميسين استعداد وإرفاق G إبرة 30½. إزالة أي فقاعات الهواء. تحريف إبرة على حقنة للتأكد من أن الطرف الزاوية على الإبرة يواجه بعيدا وعلامات حقنة تواجه الأمام، ويمكن قراءتها. لحقن السيطرة، وإعداد المحاقن والإبر مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
6. بإعداد جدول مع سطح نظيف أو وزن القارب وكذلك المناشف الورقية لتجفيف الأسماك والأسماك لعقد لحقن.
7. إعداد الحاويات نصف لتر صغيرة فردية مع الأغطية لعقد الأسماك للحقن المراقبة آخر بين عشية وضحاها. شفافة أقفاص التزاوج بلاستيكية صغيرة مفيدة لهذا الغرض. هذهيجب أن الحاويات لا تكون بيضاء - من الناحية المثالية ينبغي أن يكون واضحا بحيث يلقي الظهارية البيضاء أبكاها الأسماك يمكن ملاحظة على مقاعد البدلاء الأسود أعلى. ملء كل حاوية مع أسماك المياه ما يكفي للأسماك تسبح بشكل مريح.

2. حقن داخل الصفاق من جنتاميسين

1. تخدير الأسماك في 0.016٪ محلول تريكين في أسماك المياه. انتظر معدل التهوية الخيشومية لإبطاء وللأسماك للم تعد تستجيب للمس.
2. تلقط الأسماك باستخدام مغرفة الأسماك، والانتقال من الرأس نحو الذيل من أجل تجنب إصابة الخياشيم أو الزعانف. ضع السمك على مناشف ورقية لامتصاص الماء الزائد من خلال تحويل سمكة خارج بلطف على جانبها والتخلص من الماء الزائد من المغرفة.
3. تلقط الأسماك مرة أخرى ووضعه في وزن القوارب على نطاق وركزت وتزن السمكة. جولة لأقرب 0.25 غرام، وحساب كمية مناسبة من الجنتاميسين لحقن.
   ملاحظة: للحصول على 0.5 غرام الأسماك استخدام حقن 20 ميكرولتر في 80 ملغ / كغ جرعة.
4. تلقط الأسماك مرة أخرى ووضعه على منشفة ورقية مطوية الجافة. إذا عن طريق الحقن باستخدام اليد اليمنى، مع الاستمرار على منشفة ورقية في اليد اليسرى ووضع رأس السمكة لافتا اليسار، مع البطن يمكن الوصول إليها بسهولة.
5. عقد المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة إلى جلد البطن، سابقة لمجرور. دفع الإبرة تحت الجلد مباشرة، ثم إنقاص زاوية وحرك إبرة إلى الأمام تحت الجلد، وتجنب الأعضاء الداخلية. كساد الغطاس كمية مناسبة، وقفة للتأكد من عدم السائل هو الخروج حول الإبرة، ثم سحب الإبرة. إذا عقد السمك ثابت هو المشكلة، المرفقين هدفين ضد الجذع لتحقيق الاستقرار لهم.
   ملاحظة: ارتداء القفازات عند التعامل مع حل الجنتاميسين.
6. إسقاط كل السمك في وعاء على حدة. مراقبة الأسماك وضمان تعافيها من التخدير. حفاظ على الأسماك في 28.5 درجة مئوية خلال الليل.
   ملاحظة: إذا لم الأسماك إحياء الفور، استخدم البلاستيك العابرةفر الماصة للري المياه عبر الخياشيم لإحيائه.
7. استخدام نفس الحقنة والإبرة عند حقن الأسماك متعددة مع نفس جرعة الجنتاميسين. التخلص من المحاقن المستخدمة والإبرة في وعاء واقية الأدوات الحادة المناسبة.

3. بعد الحقن مراقبة الإصابة

1. في اليوم التالي (إصابة آخر 1 يوم)، ووضع الأسماك حقن في الحاوية الخاصة به على سطح الظلام. يجب أن يلقي البيضاء الأنسجة الظهارية الميتة تفرز عن طريق الأسماك أصيب تكون مرئية. (انظر الشكل 1E - H). إذا لم تكن هناك قوالب، سواء كانت الأسماك لم يصب بأذى من قبل حقن جنتاميسين (كانت إما جرعة منخفضة جدا، أو بعض من الجنتاميسين تسربت أثناء عملية الحقن) أو كان السمك بجروح بالغة مما أدى إلى انسداد كامل للالحالب ومجرور مع الأنسجة المنزوعة.
   ملاحظة: إذا كان السمك غير قادرة على مسح يلقي من جسمها وسوف يموت عادة في غضون 2-3 أيام، وبالتالي فهي غير صالحة للاستعمال لفترة أطولالمقايسات. إذا لم يلقي مرئية، الموت ببطء السمك في الماء تريكين عن طريق غمر لمدة 10 دقيقة على الأقل بعد توقف حركة الخياشيم.
2. إذا يلقي الأنسجة البيضاء مرئية، تعيين الأسماك جانبا ومواصلة التحقق من الأسماك الأخرى. والجرعة المناسبة من الجنتاميسين يؤدي إلى 80-90٪ من الأسماك كونها صالحة للاستعمال. تجمع الأسماك الجرحى ومن ثم تقسيمها إلى مجموعات العلاج المختلفة إذا رغبت في ذلك.

4. رعاية استعادة السمك

1. حفاظ على الأسماك في المياه النظيفة والبيئة غير مزدحم. والمياه القذرة والازدحام تؤدي إلى إصابات والموت غير مقصود. محاولة للحفاظ على ما لا يزيد عن 6 السمك / 500 مل من الماء الأسماك وتغيير المياه يوميا إن أمكن.
   ملاحظة: هذا هو الحد الأدنى من حجم للحفاظ على الفضاء أو إذا أراد المحقق لإجراء التجارب باستخدام العلاجات باهظة الثمن.
2. لا إطعام السمك حتى 3 أيام بعد الإصابة. سوف يتعافى الأسماك لا تأكل في البداية، وسوف أي طعام في خزان تتحلل وتعزيز البكتيريا غرامowth. ابتداء من الساعة 3 أيام بعد الإصابة، وإطعام كمية صغيرة مرة في اليوم.

5. تحليل المصاب الكلى

1. لالتهجين الموضعي لlhx1a التعبير مرنا في والكلى يمكن أن تحصد من الأسماك في timepoints المطلوب. الموت ببطء السمك في الماء تريكين على الجليد 10 دقيقة على الأقل حتى توقف حركة الخياشيم، ثم إزالة الرأس بشفرة حلاقة وفتح تجويف الجسم وإزالة الأعضاء الداخلية بالملقط.
2. ترك الكلية في المكان (الجهاز المصطبغة تعلق على جدار الجسم الظهرية) وتحديد الأسماك في 4٪ امتصاص العرق في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. تشريح خارج الكلى ¹⁵ وتواصل مع مستوى التهجين في الموقع.
   1. لفترة وجيزة، وغسل الكلى في PBST (الفوسفات مخزنة المالحة 0.5٪ توين 20)، permeabilized مع بروتين K في PBST (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. آخر إصلاح مع 4٪ لامتصاص العرق، وغسلها مرة أخرى مع PBST.
   2. ثم قبل هجن الكلى بين عشية وضحاها في 68؛ ° C العازلة في التهجين (50٪ الفورماميد، 5X SSC، 50 ميكروغرام / مل الهيبارين، 500 ميكروغرام / مل الحمض الريبي النووي النقال، 0.1٪ Tween20، ودرجة الحموضة 6.0).
   3. احتضان العينات مع digoxigenin المسمى التحقيق في المخزن التهجين، ثم يغسل لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما مع 100٪، 75٪، 50٪، 25٪ العازلة التهجين عند 68 ° C، ثم انتقل إلى درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين لمدة 30 دقيقة مع 2X SSC بنسبة 0.1٪ Tween20، ويغسل مرتين لمدة 30 دقيقة مع 0.2x SSC بنسبة 0.1٪ Tween20.
   4. تتوازن العينة 3X 5 دقائق في MAB (0.1 M حمض الماليك، 0.15 M كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وسدت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في MAB مع 10٪ مصل الماعز. ثم احتضان عينات بين عشية وضحاها في مكافحة digoxigenin-AP فاب 1: 5000 في MAB.
   5. غسل العينة 5X لمدة 1 ساعة في MAB، وتتوازن 3X لمدة 15 دقيقة في NTMT (0.1 M تريس pH9.5، 0.05 M MgCl _2، 0.01 M كلوريد الصوديوم، و 50 ميكرولتر Tween20).
   6. ثم علاج الكلى مع NBT / BCIP للكشف عن إشارة. إصلاح الكلى مع 4٪ لامتصاص العرق وحضنت في ثنائي ميثيل الفورماميد إلى ريمولقد الزائد NBT / BCIP، ابيض بين عشية وضحاها في الماء منزوع الأيونات. غسل الكلى ومن ثم تصوير في PBST مع 50٪ الجلسرين تحت ساترة.

النتائج

ويمكن التأكد من الإصابة جنتاميسين بصريا من قبل مراقبة يلقي الظهارية الكلوية في الماء (الشكل 1). استخدمت جرعات مختلفة من الجنتاميسين لإصابة البالغين wildtype TuAB الزرد، مما أدى إلى زيادة أعداد lhx1a + المجاميع الخلوية في الكلى تجديد (الشكل 1A - D).

Discussion

الزرد مثالية لدراسة تجديد أجهزة الكبار بما في ذلك الكبار الكلى وولفي ^6. وقد اتخذت الدراسات الحديثة الاستفادة من الواسمات الجزيئية وخطوط مراسل المعدلة وراثيا جديدة لتوصيف أفضل الخطوات التي تحدث أثناء كليون تجديد الخلايا وما قد تكون مسؤولة ^7،12. وقد استخدم ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution