Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

Özet

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Özet

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Giriş

Böbrek vücuttan akışkan homeostazı, kan basıncı düzenleme ve atık, süzme için gereklidir. Memeliler yaralanma farklılaşmış epitel hücreleri ^1-4 kullandıktan sonra mevcut nefron onarmak için mümkün olsa da, ayrılmış kök hücrelerin ⁵ havuzu eksikliği gibi görünüyor ve yeni nefron de novo oluşturmak mümkün değildir. Memelilerde aksine, yetişkin balık yaralanma ^6,7 balık büyümesini ve karşılık olarak desteklemek için yetişkin yaşam boyunca yeni nefron oluşturabildiği. Zebra balığı, Danio rerio, organ rejenerasyonu ^8-10 çalışma için paha biçilmez bir model organizmadır ve insan böbrekler onarımı mühendislik uygulamaları içine güçlü anlayışlar sağlama potansiyeline sahiptir. Tg (Lhx1a: EGFP) transgen Bununla birlikte, ^11, yetişkin zebrabalıkları böbrek ¹² yaralanma R + hücrelerinin lhx1a tepkisini kontrol eden mekanizmaların nefron progenitör hücrelerin bir havuz etiket gösterilmiştirbelirsiz Emain.

aminoglikozid gentamisin insanlarda ¹³ bilinen nefrotoksik ve ototoksik etkileri ile yaygın olarak kullanılan bir antibiyotiktir. Gentamisin intraperitoneal enjeksiyon balık ⁶ akut böbrek hasarı uyaran bir yöntemdir. Balık taklit Bu yaralanma tübüler epitel ve doz aşımı ¹⁴ gentamisin sonra insanlarda meydana glomerül yara kaybı. Gentamisin enjeksiyonu ile Zebra balığı yaralanma uyaran üretilen birçok yeni nefron ile güçlü, senkron rejenerasyon yanıtı uyaran ve aynı zamanda oluşumu, çoğalma ve farklılaşma aşamalarından geçerek geçmeden uygun bir yoldur.

Bu protokol aykırı aza indirmek için noninvaziv görsel tarama sürecinin kullanarak yetişkin zebrafish böbrek sağlam ve tekrarlanabilir yaralanma için yöntem ayrıntıları. Biz gentamisin ile yaralanma epitel böbrek dokusu ve biçimi ölümüne yol açtığı gerçeğini yararlanmakDaha sonra mezonefrik kanalları ve cloaca kitleler halinde birikir renal tübüler atmalarını, ion. Bu balıklar tarafından iletilir ve su içinde görsel olarak gözlenebilir. Bu bize daha sonra deneyler için toplanmış olabilir güçlü ölümcül olmayan yaralanma ile balık ekrana verir. Onlar deneyin bitiş daha düzgün ve verimli veri toplama ve analizi yol açar ulaşmadan önce ölmek yaralanmamış balık ya da balık sayıları en aza indirilmesi. Buna ek olarak, özel cihazlar veya reaktif akademik veya öğretim ortamında kullanılmak üzere bu yöntem maliyet-etkin ve uygun hale gereklidir. Bizim yöntemi kullanarak, burada böbrek rejenerasyonu üzerine gentamisin dozu artan etkileri yanı sıra artan sıcaklığın etkisini göstermektedir.

Protokol

NOT: Etik Beyanı: Bütün deneyler, araştırmada hayvan kullanımı için Massachusetts General Hastanesi esaslara uygun olarak yapılmıştır.

1. Ön Hazırlık

1. Kaç yetişkin zebrabalıkları 6-12 aylık yaralama belirleyin. Plan gerekli olacak% 10-20 daha fazla balık yaralama. Değişkenliği en aza indirmek için, kullanımı yaşı kabaca aynı boyutta ve daha az genetik değişkenlik için, aynı tankın birlikte yetiştirilen eş balık eşleşti. Kadın balık nedeniyle karnın geniş kapasiteli, erkek balıkların göre enjekte çok daha kolay. Ancak, erkekler ve dişiler benzer sonuçlar verir.
2. İlk kez deney yaparken, balık belirli bir suş için uygun olan gentamisin dozajı belirlemek için bir doz eğri çizilir. Gentamisin saflık partiden partiye değişiklik beri deneylerde kullanılmadan önce gentamisin her yeni toplu test edin. Uygun bir dozaj expressi değerlendirerek belirlenmelidirBöyle lhx1a olarak yaralanma belirteçlerin üzerinde. (- D Şekil 1A bakınız).
3. Gentamisin çözüm hazırlayın. Gentamisin stok çözeltisi, -20 ° C'de saklanır ve daha sonraki kullanım için çözülmüş olabilir. Örneğin, 0.5 g ağırlığındaki bir balık, bir 80 mg / kg dozda (vücut ağırlığı 80 mg gentamisin / kg) için, uygun bir çalışma çözeltisi olarak fosfat tamponlu tuzlu su içinde gentamisin 2 mg / ml hazırlar. Bu balıklara intraperitonal enjeksiyon için gentamisin 20 ul içerir.
   Not: Genellikle, 80-120 mg / kg uygun olabilir, 40 mg / kg kadar düşük iyi sonuçlar fakat dozlar elde edin. Gentamisin ayrıca laboratuvar personeline tehlikeli maruziyeti en aza indirmek için çözelti içinde satın alınabilir.
   NOT: Yüksek dozlarda Gentamisin toksik olabilir. Eldiven giyin ve toz ağırlığında zaman maske.
4. Balık anestezi için% 0.016 tricaine 100 ml su hazırlayın. Kullanılana kadar 4 ° C de pH = 7 ve saklamak için ayarlama steril MiliQ suyu içinde çözülmüş tricaine (4 g / 1 L) içindeki bir 25x stok hazırlayın. 4 m seyreltin0.016% bir çalışma konsantrasyonu balık, 100 ml su içinde l.
   NOT: işlerken Tricaine bir anestezik ve cildi tahriş olduğunu eldiven giyin.
5. Bir balık, bir kepçe şekline ampul kesme ve suyun tahliye edilmesi alt 2 yuva keserek plastik bir transfer pipet dışarı kepçe olun. Hazırlanan gentamisin çözeltisi (10 ul geçişleri ile) Yük 1ml şırınga ve bir 30½ G iğne takılır. Herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Iğne ucu açılı dönük ve şırınga işaretleri ileri ve okunabilir karşı karşıya olduğundan emin olmak için şırınga iğne bükün. Kontrol enjeksiyonları için steril PBS ile bir şırınga ve iğne hazırlar.
6. Temiz bir yüzeye sahip bir ölçek hazırlayın ya da balık kurutma ve enjeksiyon için balık tutmak için tekne yanı sıra kağıt havlu tartın.
7. Gözlem gecede sonrası enjeksiyon için balık tutmak için kapaklı bireysel küçük yarım litrelik kapları hazırlayın. Küçük şeffaf plastik birleşme kafesleri, bu amaç için yararlıdır. Bunlarkonteynerler beyaz olmamalı - balık döken beyaz epitel yayınları siyah tezgah üstünde görülebilir, böylece ideal onlar açık olmalıdır. Balık rahat yüzmek için yeterli balık suyu ile her doldurun.

Gentamisin 2. intraperitoneal enjeksiyon

1. Balık su içinde% 0.016 tricaine çözeltisi içinde balık anestezisi. Yavaş solungaç havalandırma oranı ve artık dokunmak yanıt balık bekleyin.
2. Solungaçları veya yüzgeçleri zarar önlemek için kuyruk doğru baş hareket, balık kepçe kullanarak balık kadar Scoop. Yan yavaşça balık çevirerek fazla suyu emer ve kepçe aşırı su sıyrılmaya kağıt havlu üzerine balık yerleştirin.
3. Yine balık kadar kepçe ve sıfırlanmış ölçekte tartmak tekne yerleştirin ve balık tartın. En yakın 0.25 g Yuvarlak ve enjekte etmek gentamisin uygun miktarda hesaplar.
   NOT: 0.5 gr balık için 8 de bir 20 ul enjeksiyon kullanın0 mg / kg doz.
4. Yine balık kadar kepçe ve kuru katlanmış kağıt havlu üzerine koyun. Sağ elini kullanan enjekte ise, sol elinde kağıt havlu tutun ve karın kolayca erişilebilir olan balığın baş, solu gösteren yerleştirin.
5. Kloakanın için karın cildine, anterior 45 ° açıyla iğne ile şırınga tutun. Derinin hemen altında iğneyi itin, ardından açıyı azaltmak ve iç organları kaçınarak, deri altında ileri iğne kaydırın. Daha sonra iğneyi geri çekme, hiçbir sıvı iğne etrafında geliyor emin olmak için duraklatmak, dalgıç uygun miktarda basınız. Balık sabit tutan bir sorun varsa, gövde karşı ayracı dirsekler, onları stabilize etmek.
   NOT: gentamisin çözüm tutarken eldiven giyin.
6. Bağımsız bir kabın her bir balık bırakın. Balık gözlemlemek ve anestezi onun kurtarma sağlamak. 28.5 ° C balık gecede tutun.
   NOT: Balık hemen canlandırmak etmezse, plastik trans kullanınkendi solungaçları onu canlandırmak genelinde ferin pipet su sulamak için.
7. Gentamisin aynı dozda çok balık enjekte ederken, aynı şırınga ve iğne kullanın. Uygun biohazard kesici kabına kullanılan şırınga ve iğne atınız.

Yaralanma 3. Mesaj Enjeksiyon Gözlem

1. Ertesi gün (1 gün sonrası yaralanma), karanlık bir yüzeyde kendi kabında enjekte balık yerleştirin. Yaralı balıklar tarafından atılır ölü epitel doku Beyaz yayınları görünür olmalıdır. (- H Şekil 1E bakınız). Hiçbir yayınları, yoksa her iki balık gentamisin enjeksiyonu ile yaralanan olmadı (doz ya da çok düşük, ya da enjeksiyon işlemi sırasında sızan gentamisin bazı) veya balık ciddi üreterler ve kloakanın tam tıkanma sonucu yaralandı sloughed doku ile.
   NOT: Balık genellikle 2-3 gün içinde ölecek olan vücuttan atmalarını temizlemek değiştiremiyor ve uzun süre bu nedenle kullanılamaz isetahlilleri. Hiçbir yayınları görünmüyorsa, solungaç hareketi durduktan sonra en az 10 dakika süreyle daldırarak tricaine suda balık euthanize.
2. Beyaz doku yayınları görünür durumdaysa, bir kenara balık ayarlamak ve diğer balık denetimi devam edin. Gentamisin Uygun bir doz kullanılabilir olan balık% 80-90 neden olur. Yaralı balık havuzu ve daha sonra istenirse farklı tedavi grupları bölebilirsiniz.

Kurtarma Balık 4. Bakım

1. Temiz su ve uncrowded ortamda balık tutmak. Kirli su ve kalabalık enfeksiyonları ve istenmeyen ölüme yol açacaktır. Mümkünse günlük su en fazla 6 balık / balık suyu 500 ml tutmak ve değiştirmeye çalışın.
   NOT: Bu alan korunması için ya da araştırmacı pahalı ilaç tedavileri kullanarak deneyler yapmak isterse asgari birimdir.
2. 3 gün yaralanma sonrası kadar balık yem etmeyin. Kurtarma balıklar ilk yemek olmaz ve tank içinde herhangi bir gıda ayrıştırmak ve bakteri gr teşvik edeceğizowth. 3 gün sonra, hasardan başlayarak, günde bir kez az miktarda beslenir.

Yaralı Böbrekler 5. Analizi

1. Lhx1a mRNA ifadesi için in situ hibridizasyon için, böbrekler istenilen zaman noktalarında balık hasat edilebilir. Gill hareketi duruncaya kadar buz üzerinde tricaine su içinde en az 10 dakika balık Euthanize, daha sonra, bir tıraş bıçağı ile baş kaldırmak ve vücut boşluğu açmak ve forseps ile iç organları çıkarın.
2. Yer (dorsal vücut duvara bağlı pigmentli organı) olarak böbrek bırakın ve geceleme PBS içinde% 4 paraformaldehid balık düzeltin. Böbrek ¹⁵ inceleyin ve in situ hibridizasyon standart devam edin.
   1. Kısaca, oda sıcaklığında, 1 saat süre ile PBST içinde proteinaz K (10 ug / ml) ile geçirgen PBST (Fosfat tamponlu tuzlu su,% 0.5 Tween 20) ile, böbrekler yıkayın. % 4 paraformaldehid ile Post-düzeltmek ve PBST ile tekrar yıkanır.
   2. Sonra 68 gece boyunca böbrekleri öncesi melezleşmeHibridizasyon tamponu (% 50 formamid, 5x SSC, 50 ug / ml heparin, 500 ug / ml tRNA,% 0.1 Tween20, pH 6.0) ° C'dir.
   3. Hibridizasyon tamponu içinde digoksigenin işaretli prob ile inkübe edin, daha sonra 68 ° C'de,% 100,% 75,% 50,% 25 hibritleme tamponu ile 5-10 dakika süreyle, her yıkama, daha sonra oda sıcaklığına kadar taşınır ve 30 dakika ile iki kez yıkayın 2x% 0.1 Tween20 ile SSC ve% 0.1 Tween20 ile 0.2X SSC ile 30 dakika boyunca iki kez yıkanır.
   4. MAB örnek 3x 5 dk (0.1 M maleik asit, 0.15 M NaCI, pH 7.5) ve% 10 keçi serumu ile MAB 4 ° C'de gece boyunca bloke dengelenmesi. Sonra, anti-digoksijenin-AP Fab 1 gecede örnekleri inkübe: 5,000 MAB.
   5. MAB 1 saat boyunca Örnek 5x yıkayın ve NTMT 15 dakika boyunca (0.1 M Tris pH 9.5, 0.05 M _MgCI2, 0.01 M NaCI, 50 ul Tween 20) için 3 kez dengelenmesi.
   6. Ardından sinyali tespit etmek NBT / BCIP ile böbreklerin davranın. % 4 paraformaldehit ile böbrekler düzeltmek ve remo dimetilformamid kuluçkalanmıştıriyonu giderilmiş su içinde gece boyunca ağartılmış NBT / BCIP, fazla ve. Böbrekler yıkanır ve daha sonra bir lamel altında% 50 gliserol ile PBST içinde fotoğraf.

Sonuçlar

Gentamisin yaralanma suda böbrek epitel atmalarını gözlem (Şekil 1) ile görsel teyit edilebilir. Gentamisin farklı dozajlar rejenere böbrekte lhx1a + hücre agregatları (- D Şekil 1 A) artan sayıları ıle elde edilen yetişkin vahşi tipli TuAB zebrafish zarar için kullanılmıştır. Beyaz yayınları kolayca yaralanma sonrası su 1 gün (- H Şekil 1E) görülebilir. Yüksek dozlarda balık olan atmalarını (Şekil 1I)% 75 üzer...

Tartışmalar

zebra balığı yetişkin mezonefrik böbrek ⁶ dahil olmak üzere yetişkinlerdeki organların rejenerasyonu çalışmak için idealdir. Son çalışmalar daha nefron rejenerasyon sırasında meydana gelen adımları tanımlamak için moleküler belirteçlerin ve yeni transgenik muhabiri hatları avantaj almış ve ^7,12 sorumlu neler hücreler olabilir. Idrar atmalarını Gözlem insanlarda ¹⁶ böbrek hastalığı teşhis etmek için bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution