התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

Summary

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Abstract

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introduction

הכליות היא חיוניות להומאוסטזיס נוזל, ויסות לחץ דם וסינון של פסולת מהגוף. למרות יונקים מסוגלים לתקן nephrons הקיים לאחר פציעה באמצעות תאים אפיתל מובחנים ^1-4, נראה שהם חסרי מאגר של תאי גזע שמורים ⁵ ולא מצליחין ליצור nephrons החדש דה נובו. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים יכולים ליצור nephrons החדש לאורך כל חיים בוגרים כדי לתמוך בצמיחה של הדגים ובתגובה לפציעה ^6,7. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל לא יסולא בפז לחקר התחדשות איבר ^8-10 ויש לו הפוטנציאל לספק תובנות רבות עוצמה ליישומים להנדסת התיקון של כליות אנושיות. Tg (Lhx1a: EGFP) transgene ¹¹ הוכח תווית בריכה של תאי נפרון בכליות דג הזברה המבוגר ^12, לעומת זאת מנגנוני שליטה התגובה של lhx1a + תאים לימין פציעהemain לא ברור.

גנטמיצין aminoglycoside הוא אנטיביוטיקה בשימוש נרחבת עם אפקטי nephrotoxic וototoxic ידועים בבני אדם ^13. זריקת intraperitoneal של גנטמיצין היא שיטה מבוססת של גרימת ניזק כלייתי חריף בדגים ^6. פגיעה זו במחקה דגי אובדן אפיתל וצלקות של glomeruli המתרחשת בבני אדם לאחר גנטמיצין מנת יתר ¹⁴ צינור. גרימת פציעה בדג זברה על ידי הזרקת גנטמיצין היא דרך נוחה של גרימת תגובת התחדשות חזקה, סינכרוני, עם הרבה nephrons החדש מיוצר ובו זמנית ממשיך דרך שלבים של היווצרות, שגשוג והתמיינות.

פרוטוקול זה מפרט את השיטה שלנו לפגיעה חזקה ושחזור בכליות דג הזברה המבוגר על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית כדי למזער חריגים. אנו מנצלים את העובדה שפציעה עם גנטמיצין מובילה למוות של רקמת הכליה אפיתל ופורמטיון של יציקות צינורי כליות, אשר לאחר מכן לצבור להמונים בצינורות וביב mesonephric. אלה הועברו על ידי הדגים וניתן לצפות מבחינה ויזואלית במים. זה מאפשר לנו להקרין לדגים עם פגיעה קטלנית חזקה, אשר לאחר מכן ניתן נקוותה לניסויים נוספים. מזעור המספרים של דגים או דגים ללא כל פגע שימותו לפני שהם מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי מובילה ליותר אחיד ואיסוף נתונים יעיל וניתוח. בנוסף, אין התקנים או חומרים כימיים מיוחדים נדרשים, מה שהופך את השיטה זו חסכונית ומתאימה לשימוש בסביבה אקדמית או הוראה. שימוש בשיטה שלנו, כאן אנו מראים את ההשפעות הגוברים של מינון גנטמיצין על התחדשות בכליות, כמו גם את ההשפעה של טמפרטורה עלתה.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות בית החולים כלליים מסצ'וסטס לשימוש בבעלי חיים במחקר.

1. הכנה מראש

1. לקבוע כמה מבוגרים דג הזברה ישן 6-12 חודשים כדי לפגוע. תכנית לפגוע בדגים 10-20% יותר מאשר יהיה צורך. על מנת למזער את השונות, גיל שימוש בהתאמת דגי אח שגדלו יחד באותו טנק, כך שהם בערך באותו גודל ויש לי שונות גנטיות פחות. דגי נקבה הם הרבה יותר קלים להזריק בהשוואה לדגי זכרים, בשל הקיבולת הגדולה יותר של הבטן. עם זאת, זכרים ונקבות לתת תוצאות דומות.
2. כאשר עושה הניסוי בפעם הראשונה, עלילה עקומת מינון כדי לקבוע את המינון המתאים לגנטמיצין זן ספציפי של דגים. לבדוק כל אצווה חדשה של גנטמיצין לפני השימוש בניסויים מאז טוהר גנטמיצין משתנה מיצוו אצווה. מינון נכון צריך להיקבע על ידי הערכת expressiעל פציעה של סמנים כגון lhx1a. (ראה איור 1 א - ד).
3. הכן פתרון גנטמיצין. פתרון מניות גנטמיצין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° C ומופשר לשימוש מאוחר יותר. לדוגמא, עבור 80 מ"ג / קילוגרם מינון (80 גנטמיצין מ"ג / קילוגרם ממשקל הגוף) בדגים במשקל 0.5 גרם, להכין 2 מ"ג / מיליליטר של גנטמיצין בופר פוספט כפתרון נוח עבודה. זה מספק 20 μl של גנטמיצין לזריקת intraperitoneal לדגים.
   הערה: באופן כללי, 80-120 מ"ג / קילוגרם להשיג תוצאות טובות, אך במינונים נמוכות כמו 40 מ"ג / קילוגרם עשוי להיות מתאים. גנטמיצין גם ניתן לרכוש בפתרון כדי למזער את החשיפה מסוכנת לאנשי מעבדה.
   הערה: גנטמיצין במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. ללבוש כפפות ומסכה כאשר משקל אבקה.
4. הכן של 0.016% מים tricaine 100 מיליליטר להרדמת דגים. הכן מלאי 25x של tricaine (4 g / L 1) מומסת במי MilliQ סטרילי להתאים לpH 7 וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לדלל 4 מ 'l במי דגים 100 מיליליטר לריכוז עבודה של 0.016%.
   הערה: Tricaine הוא גירוי הרדמה ועור, ללבוש כפפות בעת הטיפול.
5. הפוך דגים לגרוף מתוך pipet העברת פלסטיק על ידי חיתוך את הנורה לצורת כדור וחיתוך 2 חריצים בתחתית לניקוז מים. מזרקים 1ml העומס (עם 10 דרגות μl) עם פתרון גנטמיצין מוכן ולצרף מחט G 30½. הסר את כל בועות אוויר. לסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הזווית על המחט פונה משם ואת סימוני המזרק הם פונים קדימה וקריאים. לזריקות שליטה, להכין מזרק ומחט עם PBS סטרילי.
6. הכן בקנה מידה עם משטח נקי או לשקול סירה, כמו גם מגבות נייר לייבוש דגים ולהחזקת דגים להזרקה.
7. הכן מכולות חצי ליטר קטנים בודדות עם מכסים להחזקת דגים לפוסט לילה תצפית הזרקה. כלובי הזדווגות פלסטיק שקופים קטנים שימושיים למטרה זו. אלהמכולות לא צריכים להיות לבנה - באופן אידיאלי הם צריכים להיות ברורים כדי שיציקות אפיתל הלבנות לשפוך על ידי הדגים יכולות להיות שנצפו על גבי שחור ספסל. ממלא כל מיכל עם מספיק מים דגים לדגים לשחות בנוחות.

2. הזרקת Intraperitoneal של גנטמיצין

1. להרדים את הדגים ב0.016% פתרון tricaine במי דגים. חכה לקצב תחלופת אוויר הזימים כדי להאט ולדגים להגיב כבר לא לגעת.
2. לאסוף את הדגים באמצעות הסקופ הדגים, עובר מהראש לכיוון זנב על מנת למנוע פגיעה בזימים או סנפירים. מניחים את הדג על מגבות נייר לספיגת עודפי המים על ידי הפיכת הדגים החוצה בעדינות על צידו ולהתנער מעודפי מים מהכדור.
3. לאסוף את הדגים שוב ולמקם אותו בסירה לשקול בסולם מאופס ולשקול את הדגים. עגול ל0.25 גר 'הקרוב, ולחשב את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזריק.
   הערה: לדגים 0.5 גרם להשתמש הזרקת 20 μl בשעה 80 מ"ג / קילוגרם מינון.
4. לאסוף את הדגים שוב ומניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם הזרקה באמצעות יד ימין, להחזיק את מגבת נייר ביד השמאל והנח את ראשו של הדג הצביע שמאלה, עם הבטן נגישה בקלות.
5. החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור של הבטן, הקדמי לביב. לדחוף את המחט מתחת לעור, ואז להקטין את הזווית והחלק את המחט קדימה מתחת לעור, הימנעות האיברים הפנימיים. לוחץ על המתג הכמות המתאימה, להשהות כדי לוודא שאף נוזל יוצא סביב המחט, אז למשוך את המחט. אם מחזיק את הדגים יציבים הוא בעיה, מרפקי סד נגד פלג גוף עליון כדי לייצב אותם.
   הערה: יש להשתמש בכפפות בעת הטיפול בפתרון גנטמיצין.
6. זרוק כל דגים למכל בודד. שים לב לדגים ולהבטיח ההתאוששות שלה מהרדמה. לשמור על דגים על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: אם הדג לא להחיות באופן מיידי, להשתמש טרנס פלסטיקpipet FER להשקיית מים על פני הזימים שלו להחיות אותו.
7. השתמש באותו מזרק ומחט כאשר הזרקת דגים מרובים עם אותו המינון של גנטמיצין. השלך את המזרק המשומש ומחט לתוך המכל החדים Biohazard המתאים.

3. תצפית הזרקת הודעה של פגיעה

1. למחרת (יום לאחר פציעת 1), למקם את הדגים המוזרקים במכל שלה על משטח כהה. יציקות לבנה של רקמת האפיתל המתה מופרשת על ידי הדגים נפצעו צריכה להיות גלויות. (ראה איור 1E - H). אם אין יציקות, גם הדגים לא נפגע על ידי הזרקת גנטמיצין (או המינון היה נמוך מדי, או חלק מגנטמיצין דלף במהלך תהליך ההזרקה) או הדג נפצע קשה וכתוצאה מכך החסימה של השופכנים וביב מלא עם רקמת שהושל.
   הערה: אם הדגים אינם יכולים לנקות את היציקות מהגוף שלה זה בדרך כלל ימותו תוך 2-3 ימים ולכן לא שמיש למשך זמן ארוך יותרמבחני. אם לא יציקות גלויות, להרדים את הדג במי tricaine ידי טבילה לפחות 10 דקות אחרי תנועת הזימים מפסיקה.
2. אם יציקות רקמה הלבנות גלויות, להגדיר את הדגים בצד ולהמשיך לבדוק את הדגים האחרים. מינון מתאים של גנטמיצין יגרום 80-90% מלהיות שמיש הדגים. בריכת הדגים נפצעו ואז לפצל אותם לקבוצות טיפול שונות אם תרצה בכך.

4. טיפול בדגי שחזור

1. לשמור על דגים במים נקיים וסביבה צפופות. מים וצפיפות מלוכלכים יובילו לזיהומים ומוות בלתי צפויה. נסה לשמור על לא יותר מ 6 דגים / 500 מיליליטר של מים דגים ולהחליף את המים מדי יום במידת האפשר.
   הערה: זהו היקף מינימאלי לשימור של שטח או אם החוקר מבקש לבצע ניסויים באמצעות טיפולים תרופתיים יקרים.
2. לא להאכיל את הדגים עד 3 ימים לאחר פציעה. דגי שחזור לא לאכול בהתחלה, ואוכל כל שבטנק לפרק ולקדם גר חיידקיםowth. החל מ 3 ימים לאחר פציעה, להאכיל כמות קטנה פעם אחת ביום.

5. ניתוח של כליות נפגעים

1. לכלאה באתר לביטוי mRNA lhx1a, ניתן לקצור כליות מדגים בנקודתי זמן רצויים. להרדים דג במי tricaine על קרח לפחות 10 דקות עד שתנועת זימים מפסיקה, ולאחר מכן להסיר את הראש עם סכין גילוח ולפתוח את חלל הגוף ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים.
2. השאר את הכליות במקום (איבר פיגמנט מחובר לקיר גוף הגב) ולתקן את הדגים בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS לילה. לנתח את הכליות ¹⁵ ותמשיך עם תקן הכלאה באתר.
   1. בקצרה, לשטוף את הכליות בPBST (פוספט Tween 0.5% שנאגרו המלוח 20), permeabilized עם proteinase K בPBST (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. פוסט לתקן עם paraformaldehyde 4%, ושטף שוב עם PBST.
   2. אז לפני להכליא כליות לילה בשעה 68; ° C במאגר הכלאה (פוראמיד 50%, SSC 5x, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / מיליליטר tRNA, 0.1% Tween20, pH 6.0).
   3. דגירה הדגימות עם הבדיקה digoxigenin שכותרתו במאגר הכלאה, ולאחר מכן לשטוף למשך 5-10 דקות כל אחד עם 100%, 75%, 50%, 25% חיץ הכלאה 68 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עבר לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם 2x SSC עם 0.1% Tween20, ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם SSC 0.2X עם 0.1% Tween20.
   4. לאזן דקות המדגם 3x 5 בMAB (0.1 חומצת M maleic, 0.15 מ 'NaCl, pH 7.5) וחסמו את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בMAB עם סרום עיזים 10%. אז דגירה דגימות לילה באנטי digoxigenin-AP Fab 1: 5,000 בMAB.
   5. שטוף את 5x המדגם עבור שעה 1 בMAB, ולאזן 3x במשך 15 דקות בNTMT (0.1 מ 'טריס pH9.5, 0.05 M MgCl _2, 0.01 M NaCl, 50 μl Tween20).
   6. לאחר מכן לטפל בכליות עם NBT / BCIP כדי לזהות אותות. תקן את הכליות עם paraformaldehyde 4% וטופחו בdimethylformamide לרםיש עודף NBT / BCIP, מולבן לילה במים ללא יונים. לשטוף את הכליות ולאחר מכן לצלם בPBST עם גליצרול 50% מתחת coverslip.

תוצאות

פציעת גנטמיצין ניתן לאשר באופן חזותי על ידי ההתבוננות ביציקות אפיתל כליות במים (איור 1). מינונים שונים של גנטמיצין שמשו לפגוע דג הזברה TuAB wildtype מבוגר, וכתוצאה מכך הגדלת מספרם של lhx1a + אגרגטים הסלולר בכליות ההתחדשות (איור 1 א - ד). יכולות בקל...

Discussion

דג הזברה היא אידיאלי ללימוד התחדשות של איברים בוגרים כולל המבוגרים כליות mesonephric ^6. מחקרים שנעשו לאחרונה ניצלו סמנים מולקולריים וקווי כתב מהונדס חדשים לאפיין טוב יותר את הצעדים המתרחשים במהלך התחדשות נפרון ומה תאים עשויים להיות אחראי ^7,12. תצפית של יציקות ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution