A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Resumo

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Resumo

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introdução

O rim é essencial para a homeostase dos fluidos, regulação da pressão arterial e filtragem de resíduos do corpo. Embora os mamíferos são capazes de reparar néfrons existentes após a lesão usando células epiteliais diferenciadas ^1-4, eles parecem não ter um pool de células-tronco reservadas ⁵ e são incapazes de formar novos néfrons de novo. Em contraste com os mamíferos, peixes adultos são capazes de formar novas nefrónios ao longo da vida adulta para apoiar o crescimento dos peixes e, em resposta a uma lesão ^6,7. O peixe-zebra, Danio rerio, é um organismo modelo de valor inestimável para o estudo da regeneração de órgãos ^10/08 e tem o potencial de fornecer insights poderosos em aplicações de engenharia a reparação de rins humanos. A Tg (Lhx1a: EGFP) transgene ¹¹ foi mostrado para identificar um conjunto de células progenitoras no nefrónio do rim adulto zebrafish ^12, no entanto, os mecanismos que controlam a resposta de células lhx1a + para r lesãoemain claro.

A gentamicina é um antibiótico aminoglicosídeo amplamente utilizado com efeitos nefrotóxicos e ototóxicos conhecidos em humanos ^13. Injeção intra-peritoneal de gentamicina é um método estabelecido de induzir lesão renal aguda em peixes ^6. Esta lesão em peixes imita a perda de epitélio tubular e cicatrizes de glomérulos que ocorre em seres humanos após overdose de gentamicina ^14. Indução de lesão no peixe-zebra por injecção de gentamicina é uma maneira conveniente de induzir uma resposta forte de regeneração, síncrona, com muitas novas nefrónios produzidos e procedendo em simultâneo através de estágios de formação, diferenciação e proliferação.

Este protocolo detalhes o nosso método de lesão robusta e reproduzível no peixe-zebra rim adulto, utilizando um processo de triagem visual não invasivo para minimizar valores atípicos. Nós tirar proveito do facto de que a lesão com gentamicina leva à morte do tecido renal epitelial e formatoion de moldes tubulares renais, que depois se acumulam em massas nas condutas mesonéfricos e cloaca. Estes são passados ​​pelos peixes e pode ser observada visualmente na água. Isto permite-nos para triagem de peixe com forte lesão não-letal, que pode então ser combinadas para fazer novas experiências. Minimizando o número de peixes ou peixe ileso que morrem antes de chegar ao ponto final do experimento leva a mais uniforme e eficiente de coleta de dados e análise. Além disso, não são necessários dispositivos especiais ou reagentes, tornando este método custo-efetivo e adequado para uso em um ambiente acadêmico ou de ensino. Utilizando o nosso método, aqui mostram os efeitos de doses crescentes de gentamicina sobre a regeneração do rim, assim como o efeito do aumento da temperatura.

Protocolo

Declaração de Ética: NOTA: Todos os experimentos foram realizados de acordo com orientações Hospital Geral de Massachusetts para o uso de animais em pesquisa.

1. Preparação Prévia

1. Determine quantas adulto zebrafish 6-12 meses de idade para ferir. Plano de ferir 10-20% mais peixes do que será necessário. A fim de minimizar a variabilidade, o uso combinado de peixe irmão idade criados em conjunto no mesmo tanque de modo que eles são aproximadamente do mesmo tamanho e têm menor variabilidade genética. Peixe fêmea são muito mais fáceis de injectar em comparação com o macho de peixe, devido à maior capacidade do abdómen. No entanto, os machos e as fêmeas dão resultados semelhantes.
2. Ao fazer a experiência, pela primeira vez, traçar uma curva de dose para determinar a dosagem apropriada de gentamicina para uma estirpe específica de peixe. Testar cada novo lote de gentamicina antes do uso em experiências uma vez que a pureza de gentamicina varia de lote para lote. Dosagem adequada deve ser determinada pela avaliação expressisobre marcadores de prejuízo, tais como lhx1a. (Ver Figura 1A - D).
3. Preparar a solução de gentamicina. Solução de estoque de gentamicina pode ser armazenado em -20 ° C e descongelada para utilização posterior. Por exemplo, para um 80 mg / kg (80 mg gentamicina / kg de peso corporal) num peixe pesando 0,5 g, preparar a 2 mg / ml de gentamicina em solução salina tamponada com fosfato como uma solução de trabalho conveniente. Isto proporciona uma 20 uL de gentamicina por injecção intraperitoneal no peixe.
   NOTA: De um modo geral, 80-120 mg / kg de alcançar bons resultados, mas doses tão baixas quanto 40 mg / kg podem ser adequadas. Gentamicina também podem ser comprados em solução para minimizar a exposição perigosos para o pessoal de laboratório.
   NOTA: Gentamicina em doses elevadas pode ser tóxico. Usar luvas e máscara quando pesando pó.
4. Prepare 100 ml de 0,016% tricaina água para anestesiar peixes. Preparar um estoque de tricaina (4 g / 1 L) dissolvido em água MilliQ estéril de 25x ajustar até pH 7 e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Diluir 4 ml em 100 ml de água de peixe para uma concentração de trabalho de 0,016%.
   NOTA: tricaina é um anestésico e pele irritante, usar luvas ao manusear.
5. Faça um peixe colher fora de uma pipeta de transferência de plástico cortando o bulbo em forma de colher e corte de 2 slots no fundo para drenar a água. Seringas de 1ml de carga (com 10 gradações ul) com a solução de gentamicina preparado e anexar uma agulha G 30½. Remova as bolhas de ar. Torça a agulha da seringa para se certificar de que a ponta angular sobre a agulha está enfrentando afastado e as marcas de seringa são voltadas para a frente e legível. Para injeções de controle, preparar uma seringa e agulha estéril com PBS.
6. Prepare uma escala com uma superfície limpa ou pesar barco, bem como toalhas de papel para secar peixes e para a realização de peixes para injecção.
7. Prepare pequenos recipientes individuais de meio litro com tampa para a realização de peixes para observação pós durante a noite injeção. As pequenas gaiolas transparentes acasalamento plástico são úteis para este fim. EstesOs contentores não deve ser branco - idealmente, devem ser claras para que os moldes epiteliais brancas derramadas pelos peixes podem ser observados numa bancada de preto. Encha cada recipiente com água peixe suficiente para os peixes a nadar confortavelmente.

2. Injecção Intraperitoneal de gentamicina

1. Anestesiar os peixes em solução tricaina 0,016% em água peixe. Aguarde até que a taxa de ventilação branquial a abrandar e que o peixe já não respondem ao toque.
2. Recolher o peixe usando a colher peixes, movendo-se de cabeça na direção da cauda, ​​a fim de evitar ferir as guelras ou barbatanas. Coloque o peixe em papel toalha para absorver o excesso de água, girando o peixe fora suavemente em seu lado e sacuda o excesso de água do furo.
3. Recolher o peixe novamente e colocá-lo no barco pesar na escala zerada e pesar o peixe. Redondo com a aproximação de 0,25 g, e calcular a quantidade adequada de gentamicina a injectar.
   NOTA: Para uma 0,5 g de peixe usam uma injecção de 20 ul às 80 mg / kg dose.
4. Recolher o peixe novamente e coloque-o sobre uma toalha de papel dobrado seco. Se injetar com a mão direita, segure a toalha de papel na mão esquerda e coloque a cabeça do peixe apontando para a esquerda, com a barriga de fácil acesso.
5. Segurar a seringa com a agulha com um ângulo de 45 ° para a pele do ventre, anterior para a cloaca. Empurrar a agulha debaixo da pele, então diminuir o ângulo e deslizar para a frente a agulha sob a pele, evitando os órgãos internos. Empurrar o êmbolo a quantidade adequada, pausa para garantir que nenhum líquido está saindo em torno da agulha, em seguida, retirar a agulha. Se segurando o peixe é um problema constante, cotovelos cinta contra o torso para estabilizá-los.
   NOTA: Utilize luvas ao manusear solução de gentamicina.
6. Solte cada peixe em um recipiente individual. Observar os peixes e garantir a sua recuperação da anestesia. Manter os peixes a 28,5 ° C durante a noite.
   NOTA: Se o peixe não reviver imediatamente, use um plástico transfer pipeta para irrigar água através de suas brânquias de reanimá-lo.
7. Utilizar a mesma seringa e agulha, aquando da injecção peixe múltiplos com a mesma dose de gentamicina. Elimine a seringa ea agulha usado para o recipiente de risco biológico farelos apropriado.

3. Publicar Injeção Observação de Lesão

1. No dia seguinte (um dia após a lesão), coloque o peixe injetado em seu recipiente sobre uma superfície escura. Elencos brancas de tecido epitelial mortos excretado pelos peixes feridos devem ser visíveis. (Ver Figura 1E - H). Se não existem moldes, ou o peixe não foi lesionado por injecção de gentamicina (ou a dose é muito baixa, ou alguma da gentamicina vazado durante o processo de injecção) ou o peixe foi gravemente ferido, resultando em um bloqueio completo dos ureteres e da cloaca com tecido descartado.
   NOTA: Se o peixe é incapaz de limpar os moldes de seu corpo, geralmente morrem dentro de 2-3 dias e é, portanto, inutilizáveis ​​por mais tempoensaios. Se não há elencos são visíveis, eutanásia do peixe na água tricaina por imersão durante pelo menos 10 minutos após o movimento de emalhar pára.
2. Se elencos dos tecidos brancos são visíveis, defina o peixe de lado e continuar a verificar os outros peixes. Uma dose apropriada de gentamicina resultará em 80-90% de o peixe ser utilizável. A piscina do peixe ferido e, em seguida, divida-os em diferentes grupos de tratamento, se desejar.

4. Cuidados de Recuperação de Peixe

1. Manter os peixes em água limpa e meio ambiente sem aglomeração. A água suja e aglomeração vai levar a infecções e morte não intencional. Tente manter não mais do que 6 peixes / 500 ml de água de peixe e trocar a água diariamente, se possível.
   NOTA: Este é um volume mínimo para a conservação do espaço ou se o investigador deseja realizar experimentos usando tratamentos com medicamentos caros.
2. Não alimente o peixe até 3 dias após a lesão. Recuperando peixe não vai comer no início, e qualquer alimento no tanque vai se decompor e promover bactérias growth. A partir de 3 dias após o ferimento, alimentar uma pequena quantidade, uma vez por dia.

5. Análise de feridos Rins

1. Para a hibridização in situ para a expressão do mRNA lhx1a, rins podem ser colhidas a partir de peixes em intervalo de tempo desejados. Euthanize peixe na água tricaina em gelo pelo menos 10 minutos até que o movimento de emalhar pára, em seguida, remover a cabeça com uma lâmina de barbear e abrir a cavidade do corpo e remover os órgãos internos com uma pinça.
2. Deixar o rim no lugar (órgão pigmentada fixada na parede do corpo dorsal) e corrigir o peixe em paraformaldeído a 4% em PBS durante a noite. Dissecar o rim ¹⁵ e continuar com o padrão de hibridação in situ.
   1. Resumidamente, lavar os rins em PBST (solução salina tamponada com fosfato 0,5% de Tween 20), permeabilizadas com proteinase K em PBST (10 ug / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente. Pós-corrigir com paraformaldeído a 4%, e lavou-se novamente com PBST.
   2. Em seguida, pré-hibridação dos rins durante a noite a 68; ° C em tampão de hibridação (formamida a 50%, 5x SSC, 50 ug / ml de heparina, 500 ug / ml de ARNt, 0,1% de Tween 20, pH 6,0).
   3. Incubar as amostras com digoxigenina marcado sonda em tampão de hibridação, em seguida, lavar durante 5-10 minutos cada, com 100%, 75%, 50%, 25% de tampão de hibridação a 68 ° C, em seguida, mudou-se para a temperatura ambiente e lava-se duas vezes durante 30 min com 2 x SSC com 0,1% de Tween 20, e lava-se duas vezes durante 30 min com 0,2x SSC com 0,1% de Tween20.
   4. Equilibrar a amostra 3x 5 min em MAB (0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) e bloqueadas durante a noite a 4 ° C em MAB com 10% de soro de cabra. Em seguida, incubar amostras durante a noite em anti-digoxigenina-AP Fab 1: 5.000 em MAB.
   5. Lava-se a 5x amostra durante 1 h em MAB, e equilibrar 3x durante 15 minutos em NTMT (0,1 M de Tris pH 9,5, 0,05 M de _MgCl2, 0,01 M de NaCl, 50 uL de Tween 20).
   6. Em seguida, tratar os rins com NBT / BCIP para detectar o sinal. Corrigir os rins com paraformaldeído a 4% e incubadas em dimetilformamida a remove excesso de NBT / BCIP, branqueada durante a noite em água deionizada. Lavar os rins e, em seguida, fotografar em PBST com 50% de glicerol sob uma lamela.

Resultados

Lesão de gentamicina pode ser confirmado visualmente pela observação de moldes epiteliais renais em água (Figura 1). Diferentes doses de gentamicina foram usadas para ferir adulto zebrafish wildtype TuAB, resultando em um número crescente de lhx1a + agregados celulares no rim regeneração (Figura 1A - D). Gesso branco pode ser facilmente visto na água um dia após a lesão (Figura 1E - H). Uma baixa dose de gentamicina r...

Discussão

O peixe-zebra é ideal para estudar a regeneração de órgãos adultos, incluindo o rim adulto mesonephric ^6. Estudos recentes têm se aproveitado de marcadores moleculares e novas linhas repórter transgénico para melhor caracterizar as etapas que ocorrem durante a regeneração de néfrons e quais as células podem ser responsáveis ^​​7,12. Observação de cilindros urinários foi usado para mais de um século, para diagnosticar a doença renal em seres humanos ^16. Aqui usamos a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution