Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Riepilogo

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Abstract

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Introduzione

Il rene è essenziale per l'omeostasi del fluido, la regolazione della pressione sanguigna e la filtrazione dei rifiuti dal corpo. Anche se i mammiferi sono in grado di riparare i nefroni esistenti dopo la lesione utilizzando cellule epiteliali differenziate ^1-4, sembrano mancare di un pool di cellule staminali riservati ⁵ e sono in grado di formare nuovi nefroni de novo. A differenza dei mammiferi, i pesci adulti sono in grado di formare nuovi nefroni per tutta la vita adulta per sostenere la crescita del pesce e in risposta al danno ^6,7. Il zebrafish, Danio rerio, è un organismo modello prezioso per lo studio della rigenerazione degli organi ^8-10 e ha il potenziale per fornire potenti intuizioni in applicazioni per l'ingegneria la riparazione di reni umani. Il Tg (Lhx1a: EGFP) transgene ¹¹ ha dimostrato di etichettare un pool di cellule progenitrici nephron in zebrafish adulti rene ^12, tuttavia i meccanismi che controllano la risposta delle cellule lhx1a + al danno rEmain chiaro.

La gentamicina aminoglicoside è un antibiotico ampiamente usato con noti effetti nefrotossici e ototossici nell'uomo ^13. Iniezione intraperitoneale di gentamicina è un metodo consolidato di indurre danno renale acuto nei pesci ^6. Questa lesione nel pesce imita la perdita dell'epitelio tubolare e cicatrici di glomeruli che si verifica negli esseri umani dopo gentamicina sovradosaggio ^14. Indurre lesioni in zebrafish per iniezione gentamicina è un modo conveniente di indurre una forte risposta rigenerazione sincrono, con molti nuovi nefroni prodotte e, contemporaneamente, di procedere attraverso le fasi di formazione, la proliferazione e la differenziazione.

Dettagli Questo protocollo il nostro metodo per lesioni robusto e riproducibile in zebrafish adulti rene utilizzando un processo di screening non invasivo visivo per ridurre al minimo i valori anomali. Approfittiamo del fatto che il pregiudizio con gentamicina porta alla morte del tessuto renale epiteliali e formatoioni di calchi tubulari renali, che poi si accumulano in masse nei condotti mesonefrici e cloaca. Questi sono passati dai pesci e possono essere osservati visivamente in acqua. Questo ci permette di schermo per il pesce con forte infortunio non letale, che può essere messo in comune per ulteriori sperimentazioni. Minimizzare il numero di pesci illeso o pesce che muoiono prima di raggiungere il punto finale dell'esperimento porta a più uniforme ed efficiente la raccolta di dati e di analisi. Inoltre, non sono richiesti particolari dispositivi o reagenti, rendendo questo metodo conveniente e adatto per l'uso in un ambiente accademico o di insegnamento. Utilizzando il nostro metodo, qui mostriamo effetti sempre maggiori delle dosi gentamicina sulla rigenerazione del rene, nonché l'effetto di aumento della temperatura.

Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida del Massachusetts General Hospital per l'impiego di animali nella ricerca.

1. preparazione preliminare

1. Determinare il numero di adulti zebrafish 6-12 mesi di ferire. Piano per ferire il 10-20% in più pesce di quanto sarà necessario. Per ridurre al minimo la variabilità, utilizzo età abbinato pesci allevati sibling insieme nella stessa vasca in modo che siano all'incirca le stesse dimensioni e la variabilità genetica meno. Pesci femminili sono molto più facile per iniettare rispetto al pesce maschio, a causa della maggiore capacità dell'addome. Tuttavia, i maschi e le femmine danno risultati simili.
2. Quando si esegue l'esperimento per la prima volta, tracciare una curva dose per determinare il dosaggio appropriato gentamicina per uno specifico ceppo di pesci. Verificare ogni nuovo lotto di gentamicina prima dell'uso in esperimenti dal momento che la purezza di gentamicina varia da lotto a lotto. La dose deve essere determinato valutando expressisu di marcatori di pregiudizio, come lhx1a. (Vedi Figura 1A - D).
3. Preparare la soluzione di gentamicina. Gentamicina soluzione madre può essere conservata a -20 ° C e scongelato per un uso successivo. Ad esempio, per una dose di 80 mg / kg (80 mg / kg gentamicina di peso corporeo) in un pesce del peso di 0,5 g, preparare 2 mg / ml di gentamicina in tampone fosfato come una soluzione di lavoro comoda. Questo fornisce un 20 microlitri di gentamicina per iniezione intraperitoneale nel pesce.
   NOTA: In generale, 80-120 mg / kg ottenere buoni risultati, ma dosi di 40 mg / kg può essere appropriato. Gentamicina può anche essere acquistato in soluzione per ridurre al minimo l'esposizione pericolosa al personale di laboratorio.
   NOTA: Gentamicina in dosi elevate può essere tossico. Indossare guanti e maschera nel valutare in polvere.
4. Preparare 100 ml di acqua tricaine 0,016% per anestetizzare il pesce. Preparare uno stock 25x di tricaine (4 g / 1 L) disciolto in acqua sterile MilliQ regolare a pH 7 e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Diluire 4 ml in 100 ml di acqua pesce per la soluzione di lavoro di 0,016%.
   NOTA: Tricaine è un anestetico e pelle irritante, indossare guanti durante la manipolazione.
5. Fare un pesce paletta da un pipetta plastica tagliando la lampadina a forma di paletta e taglio 2 slot nella parte inferiore per drenare l'acqua. Siringhe carico 1ml (con 10 gradazioni microlitri) con la soluzione di gentamicina preparata e attribuiscono un ago G 30½. Rimuovere eventuali bolle d'aria. Girare l'ago della siringa per fare in modo che la punta angolata sul ferro sia rivolta e le marcature siringa si trovano ad affrontare in avanti e leggibile. Per le iniezioni di controllo, preparare una siringa e l'ago con PBS sterile.
6. Preparare una scala con una superficie pulita o pesare barca così come i tovaglioli di carta per asciugare il pesce e per lo svolgimento di pesce per l'iniezione.
7. Preparare singoli contenitori piccole da mezzo litro con coperchio per lo svolgimento di pesce per l'iniezione di osservazione posto durante la notte. Piccole gabbie di plastica accoppiamento trasparenti sono utili per questo scopo. Questecontenitori non devono essere bianco - idealmente dovrebbero essere chiaro in modo che i calchi epiteliali bianchi versate dai pesci possono essere osservati in cima a una panchina nera. Riempire ogni contenitore con acqua abbastanza pesce per il pesce a nuotare comodamente.

2. iniezione intraperitoneale di gentamicina

1. Anestetizzare il pesce nella soluzione tricaine 0,016% in acqua i pesci. Attendere che il tasso di ventilazione branchia per rallentare e per il pesce a rispondere non più al tatto.
2. Raccogliere il pesce con la paletta pesce, muovendo dalla testa verso la coda, al fine di evitare di ferire le branchie o pinne. Mettere il pesce su carta assorbente per assorbire l'acqua in eccesso ruotando il pesce con delicatezza su un fianco e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso dal scoop.
3. Raccogliere il pesce di nuovo e metterlo in barca pesare sulla bilancia azzerato e pesare il pesce. Rotonda con l'approssimazione di 0,25 g, e calcolare la giusta quantità di gentamicina da iniettare.
   NOTA: Per un 0,5 g di pesce utilizzare una iniezione di 20 ml a 80 dose mg / kg.
4. Raccogliere il pesce di nuovo e metterlo su un tovagliolo di carta piegato a secco. Se l'iniezione con la mano destra, tenere il tovagliolo di carta nella mano sinistra e mettere la testa del pesce che punta a sinistra, con la pancia facilmente accessibile.
5. Tenere la siringa con l'ago con un angolo per la pelle della pancia, anteriore alla cloaca 45 °. Spingere l'ago sotto la pelle, quindi diminuire l'angolo e far scorrere l'ago in avanti sotto la pelle, evitando gli organi interni. Spingere il pistone la giusta quantità, mettere in pausa per assicurarsi che nessun liquido esce intorno all'ago, quindi estrarre l'ago. Se tiene il pesce costante è un problema, gomiti bretelle contro tronco per essere stabilizzati.
   NOTA: Maneggiare con guanti soluzione di gentamicina.
6. Eliminare ogni pesce in un singolo contenitore. Osservare il pesce e assicurarne il recupero dall'anestesia. Mantenere pesce a 28,5 ° C durante la notte.
   NOTA: Se il pesce non rivivere subito, utilizzare un trans plasticafer pipetta per irrigare l'acqua attraverso le branchie di rianimarlo.
7. Utilizzare lo stesso siringa e l'ago quando si inietta pesce multipla con la stessa dose di gentamicina. Smaltire la siringa usata e l'ago nel apposito contenitore per rischio biologico taglienti.

3. osservatorio Iniezione di lesioni

1. Il giorno successivo (lesione dopo 1 giorno), posizionare il pesce iniettato nel suo contenitore su una superficie scura. Calchi bianche di tessuto epiteliale morti escreta dai pesci feriti dovrebbero essere visibili. (Vedi Figura 1E - H). Se non ci sono calchi, o il pesce non è stato ferito dall'iniezione gentamicina (sia la dose era troppo bassa, o alcune delle gentamicina fuoriuscito durante il processo di iniezione) o il pesce era gravemente ferito conseguente blocco completo degli ureteri e cloaca con il tessuto sloughed.
   NOTA: Se il pesce non è in grado di cancellare i calchi dal suo corpo che di solito muoiono entro 2-3 giorni ed è quindi inutilizzabile per piùsaggi. Se non calchi sono visibili, eutanasia il pesce in acqua tricaine immergendo per almeno 10 minuti dopo il movimento branchia si arresta.
2. Se calchi tessuto bianche sono visibili, impostare il pesce da parte e continuare a controllare lo altri pesci. Una dose appropriata di gentamicina comporterà 80-90% del pesce essere utilizzabile. Pool i pesci feriti e poi divisi in diversi gruppi di trattamento, se desiderato.

4. Cura di Recupero di pesce

1. Tenere pesce in acqua pulita e ambiente poco affollate. Acqua sporca e affollamento sarà portare a infezioni e la morte involontaria. Cercate di mantenere non più di 6 pesci / 500 ml di acqua pesce e cambiare l'acqua ogni giorno, se possibile.
   NOTA: Si tratta di un volume minimo per la conservazione di spazio o se il ricercatore desidera effettuare esperimenti utilizzando trattamenti farmacologici costosi.
2. Non date da mangiare il pesce fino a 3 giorni dopo l'infortunio. Pesce Recupero non mangeranno in un primo momento, e qualsiasi cibo nel serbatoio si decompongono e promuovere batteri growth. Partendo a 3 giorni dopo lesioni, alimentare una piccola quantità una volta al giorno.

5. Analisi di feriti Reni

1. Per l'ibridazione in situ per l'espressione lhx1a mRNA, i reni possono essere raccolte da pesce timepoints desiderati. Eutanasia pesce in acqua tricaine su ghiaccio di almeno 10 minuti fino a quando il movimento branchia si arresta, quindi rimuovere la testa con una lametta e aprire la cavità del corpo e rimuovere gli organi interni con una pinza.
2. Lasciare il rene a posto (organo pigmentato attaccato alla parete dorsale del corpo) e fissare il pesce in 4% paraformaldeide in PBS durante la notte. Sezionare il rene ¹⁵ e continuare con lo standard ibridazione in situ.
   1. Brevemente, lavare i reni in PBST (tampone fosfato 0,5% Tween 20), permeabilizzate con proteinasi K in PBST (10 ug / ml) per 1 ora a temperatura ambiente. Post-fissare con 4% paraformaldeide, e lavato ancora con PBST.
   2. Poi pre-ibridare i reni durante la notte a 68; ° C in tampone di ibridazione (50% formammide, 5x SSC, 50 ug / ml di eparina, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0).
   3. Incubare i campioni con digossigenina marcato sonda nel tampone di ibridazione, quindi lavare per 5-10 min ciascuno con 100%, 75%, 50%, 25% tampone di ibridazione a 68 ° C, poi si trasferisce a temperatura ambiente e lavata due volte per 30 min con 2x SSC con 0,1% Tween20, e lavare due volte per 30 min con 0.2x SSC con 0,1% di Tween20.
   4. Equilibrare campione 3x 5 min a MAB (0,1 M di acido maleico, 0,15 M di NaCl, pH 7,5) e bloccate notte a 4 ° C in MAB con siero di capra 10%. Poi incubare i campioni durante la notte in anti-digossigenina-AP Fab 1: 5.000 a MAB.
   5. Lavare il 5x campione per 1 ora in MAB ed equilibrare 3x per 15 min a NTMT (0.1 M Tris pH9.5, 0,05 M MgCl _2, 0,01 M di NaCl, 50 microlitri Tween20).
   6. Poi trattare i reni con NBT / BCIP per rilevare il segnale. Fissare i reni con paraformaldeide al 4% e incubate in dimetilformammide a remove eccesso NBT / BCIP, sbiancato notte in acqua deionizzata. Lavare i reni e poi fotografare in PBST con il 50% di glicerolo sotto un vetrino.

Risultati

Infortunio gentamicina può essere confermata visivamente dall'osservazione di calchi epiteliali renali in acqua (Figura 1). Diverse dosi di gentamicina sono stati usati per danneggiare adulto tipo selvatico TuAB zebrafish, con conseguente aumento del numero di lhx1a + aggregati cellulari nel rene rigenerante (Figura 1A - D). Calchi bianche possono essere facilmente visibile in acqua 1 giorno dopo la lesione (Figura 1E - H).

Discussione

Il pesce zebra è ideale per studiare la rigenerazione di organi adulti tra cui il rene mesonefrico ⁶ adulti. Recenti studi hanno approfittato di marcatori molecolari e nuove linee giornalista transgenici per caratterizzare meglio i passaggi che si verificano durante la rigenerazione nefrone e quali le cellule potrebbero essere responsabili ^7,12. Osservazione di calchi urinari è stata utilizzata da più di un secolo per diagnosticare la malattia del rene nell'uomo ^16. Qui si usa la ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution