ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

要約

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

要約

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

概要

腎臓は、身体からの体液の恒常性、血圧調節および廃棄物のろ過のために不可欠です。哺乳動物は怪我が分化した上皮細胞^1-4を使用した後、既存のネフロンを修復することができますが、それらは予約済みの幹細胞⁵のプールを欠いているように見えるし、新しいネフロンデノボを形成することができません。哺乳類とは対照的に、成魚魚の成長および傷害^6,7に応答をサポートするために、成人期を通じて新しいネフロンを形成することができます。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、臓器再生^8-10の研究のための貴重なモデル生物であり、ヒトの腎臓の修復を操作するためのアプリケーションに強力な洞察を提供する可能性があります。 Tgは（Lhx1a：EGFP）導入遺伝子^11は、しかし^、機構が損傷rにlhx1a +細胞の応答を制御する、大人のゼブラフィッシュの腎臓¹²にネフロン前駆細胞のプールを標識することが示されています不明emain。

アミノグリコシドゲンタマイシンは、ヒト¹³における既知の腎毒性及び聴器毒性効果と広く使用されている抗生物質です。ゲンタマイシンの腹腔内注射は、魚⁶に急性腎損傷を誘導する確立された方法です。魚の模倣でこの傷害細管上皮や過剰摂取^{14ゲンタマイシン}した後、ヒトに起こる糸球体の瘢痕化の損失。多くの新しいネフロンが生成され、同時に形成、増殖および分化の段階を経て進んでゲンタマイシン注射によってゼブラフィッシュにおける傷害を誘導することは、強力な、同期再生応答を誘導する便利な方法です。

このプロトコルは、外れ値を最小化するために非侵襲的な視覚的なスクリーニングプロセスを利用して大人のゼブラフィッシュの腎臓における堅牢性と再現性の損傷のための私達の方法を詳述します。私たちは、ゲンタマイシンとの損傷が、上皮腎臓組織と形式の死につながるという事実を利用しますその後、中腎管および排出腔に塊に蓄積し、尿細管円柱、のイオン。これらは、魚に渡され、水中で視覚的に観察することができます。これは、私たちはその後、さらなる実験のためにプールすることができる強力な非致死傷害、と魚をスクリーニングすることができます。これらは、実験のエンドポイントは、より均一で効率的なデータ収集と分析につながる達する前に死亡無傷魚または魚の数を最小限に抑えます。また、特別な装置や試薬は、この方法の費用対効果や学術や指導設定で使用するための適切なを作り、必要ありません。私たちの方法を使用して、ここでは、腎臓の再生にゲンタマイシン投与量の増大効果だけでなく、上昇した温度の影響を示します。

プロトコル

注：倫理の声明：すべての実験は、研究における動物使用のためのマサチューセッツ総合病院のガイドラインに従って行いました。

1.事前準備

1. どのように多くの大人のゼブラフィッシュの6-12ヶ月のを傷つけるために決定します。必要とされるよりも10〜20％より多くの魚を傷つけることを計画。それらはほぼ同じ大きさであり、以下の遺伝的多様性を有するように可変性を最小限にするために、使用年齢は同じタンクで一緒に飼育魚の兄弟に一致しました。女性の魚が原因腹部の大容量に、男性の魚に比べて注入する方がはるかに簡単です。しかし、男性および女性は同様の結果を与えます。
2. 初めての実験を行うときに、魚の特定の株について適切なゲンタマイシン投与量を決定するために、用量曲線をプロットします。ゲンタマイシンの純度がバッチ毎に変化するため、実験で使用する前にゲンタマイシンの各新しいバッチをテストします。適切な用量はexpressiを評価することによって決定されるべきですこのようなlhx1aとして傷害マーカーの上。 （ - D図1Aを参照してください）。
3. ゲンタマイシン溶液を調製します。ゲンタマイシンストック溶液を-20℃に保存し、後の使用のために解凍することができます。例えば、0.5グラムの重さの魚で80ミリグラム/ kgの投与量（体重の80mgのゲンタマイシン/ kg）のために、便利な使用液としてリン酸緩衝生理食塩水でのゲンタマイシンの2 mg / mlのを準備します。これは魚に腹腔内注射のためのゲンタマイシンの20μLを提供しています。
   注：一般的に、80〜120ミリグラム/ kgで適切であるかもしれないの40mg / kgという低い良好な結果が、投与量を達成します。ゲンタマイシンはまた、研究室の人員への危険な暴露を最小限にするために、溶液中に購入することができます。
   注：高用量でのゲンタマイシンは、毒性であり得ます。粉末を計量する際、手袋とマスクを着用してください。
4. 魚を麻酔するための0.016パーセントのトリカインの100mlの水を準備します。使用するまで4℃でpHを7と店に調整し、滅菌ミリQ水に溶解しトリカイン（4グラム/ 1 L）の25倍の在庫を準備します。 4メートルを希釈0.016パーセントの作業濃度用の魚の水100mlでL。
   注：トリカインが取り扱う際は手袋を着用し、麻酔薬や皮膚刺激性です。
5. 魚がスクープ形状に電球をカットし、水を排出するために底部に2つのスロットを切断することにより、プラスチック転送ピペットのかき出すことを確認します。準備されたゲンタマイシン溶液と負荷（10μlの階調の）1ミリリットルの注射器と30½G針を取り付けます。任意の気泡を除去。針の角度のついた先端が離れて直面していると、シリンジのマーキングが前進し、読み取り可能で直面していることを確認するために、注射器の針をねじります。コントロール注射のために、滅菌PBSで注射器と針を準備します。
6. 清浄な表面でスケールを準備したり、魚を乾燥させるために、注入のために魚を保持するためのボートだけでなく、紙タオルの重量を量ります。
7. 観測一夜ポスト噴射のために魚を保持するための蓋と各小0.5リットルの容器を準備します。小さな透明プラスチック交配ケージは、この目的のために有用です。これらの容器は白であってはならない - 魚に当てる白色上皮キャストが黒の作業台の上に観察できるように、理想的に、彼らは明確にする必要があります。快適に泳ぐ魚のための十分な魚の水で各容器を満たします。

ゲンタマイシンの2腹腔内注射

1. 魚の水中の0.016パーセントのトリカイン溶液に魚を麻酔。遅くする鰓換気率のために、もはや触れること応答しないために魚を待ちます。
2. えらやフィンが負傷しないようにするために、ヘッドからテイルに向かって移動し、魚のスコップを使って魚をすくい上げます。その側で静かに魚を回して余分な水分を吸収し、スクープから余分な水分を振り払うためにペーパータオルの上に魚を置きます。
3. 再び魚をすくい上げると、ゼロ化された規模で秤量ボートに置き、魚の重量を量ります。最寄りの0.25グラムにラウンドし、注入するゲンタマイシンの適切な量を計算します。
   注：0.5グラムの魚のために8で20μlの注入を使用します0ミリグラム/ kgの用量。
4. 再び魚をすくい上げるとドライ折り畳まれた紙タオルの上に置きます。右手を使用して注入する場合は、左の手にペーパータオルを保持し、簡単にアクセス腹で、左向きの魚の頭を置きます。
5. 排出腔への腹の皮膚、前方に45°の角度で針と注射器を持ちます。角度を減少させ、内臓を避け、皮膚の下に前方に針をスライドさせ、皮膚のすぐ下に針を押してください。その後、針を撤回、液体が針の周りに出ていないことを確認する一時停止、プランジャ適量を押します。安定した魚を保持することは問題である場合は、それらを安定させるために胴体に対して肘を引き締めます。
   注：ゲンタマイシン溶液を取り扱う際は手袋を着用してください。
6. 個々の容器にそれぞれの魚をドロップします。魚を観察し、麻酔からの回復を確実。 28.5℃で魚を一晩おいてください。
   注：魚はすぐに復活しない場合は、プラスチック製のトランスを使用それを復活させるために、その鰓を横切って水を灌漑するFERピペット。
7. ゲンタマイシンの同じ用量で複数の魚を注入する際、同じ注射器と針を使用してください。適切なバイオハザードシャープコンテナに使用される注射器と針を処分。

傷害の3ポスト噴射観測

1. 次の日（1日後の傷害）、暗い表面に、その容器内に注入された魚を置きます。負傷した魚によって排泄死んだ上皮組織のホワイトキャストが表示されるはずです。 （ 図1Eを参照してください- H）。何のキャストがない場合は、どちらかの魚がゲンタマイシン注射によりけがはなかった（投与量のいずれかが低すぎた、または射出プロセス中に漏れたゲンタマイシンの一部）や魚がひどく尿管および総排泄腔の完全な遮断をもたらす負傷しました酔っぱらった組織と。
   注：魚は、その本体からキャストをクリアすることができない場合は、通常2〜3日以内に死亡し、長く、したがって使用できないでしょうアッセイ。何のキャストが表示されていない場合は、鰓の動きが停止した後、少なくとも10分間浸漬することによりトリカイン水中で魚を安楽死させます。
2. 白色組織キャストが表示されている場合は、別に魚を設定し、他の魚のチェックを続け。ゲンタマイシンの適切な用量は、魚が使用可能であることの80〜90％になります。負傷した魚をプールした後、必要に応じて、異なる処理群に分割して。

魚の回収4.ケア

1. きれいな水と混雑環境で魚を保管してください。汚れた水と混雑は感染症や意図しない死につながります。これ以上6以下の魚/魚の水500mlを維持し、可能な場合は、毎日水を変更してみてください。
   注：これは、空間の保全のための最小量であるか、または研究者は、高価な薬物治療を用いた実験を行いたい場合。
2. 3日は、損傷後まで魚を餌を与えないでください。魚を回収すること、最初は食べないし、タンク内のすべての食品は、細菌グラムを分解し、推進していきますowth。 3日目に開始すると、損傷後、一日一回、少量を養います。

負傷腎臓の5分析

1. lhx1a mRNA発現のためのin situハイブリダイゼーションのために、腎臓は、所望の時点で魚から採取することができます。鰓の動きが停止するまで、次にかみそりの刃でヘッドを取り外して、体腔を開き、鉗子で内臓を除去し、氷、少なくとも10分にトリカイン水に魚を安楽死させます。
2. 代わりに腎臓を残す（背側体壁に取り付けられた着色された臓器）、一晩PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で魚を修正。腎臓^15を解剖し、in situハイブリダイゼーション標準に進みます。
   1. 簡単に説明すると、室温で1時間、PBST中でプロテイナーゼK（10μg/ ml）で透過処理PBST（リン酸緩衝生理食塩水、0.5％のツイーン20）で腎臓を洗浄します。 4％パラホルムアルデヒドで後固定し、PBSTで再度洗浄しました。
   2. その後、68で一晩腎臓を事前ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、5×SSC、50μg/ mlのヘパリン、500 / mlのtRNAを、0.1％のTween20、pH6.0）で中°C。
   3. ハイブリダイゼーション緩衝液中でジゴキシゲニン標識プローブとサンプルをインキュベートし、その後、100％、75％、50％、68℃、25％ハイブリダイゼーション緩衝液で各々5〜10分間洗浄し、次いで、室温に移動しながら30分間、二回洗浄0.1％Tween20でSSCを2倍、0.1％Tween20で0.2×のSSCで30分間、二回洗浄します。
   4. MABのサンプル3×5分（0.1 Mマレイン酸、0.15 M塩化ナトリウム、pHは7.5）を平衡化し、10％ヤギ血清とM​​ABに4℃で一晩ブロッキングしました。その後、抗ジゴキシゲニンAPのFab 1で一晩試料をインキュベート：MABで5,000。
   5. MABで1時間サンプル5回洗浄し、NTMTで15分（0.1MトリスpH9.5、0.05 MのMgCl _2、0.01 MのNaCl、50μLのトゥイーン20）のために3回平衡化。
   6. その後、信号を検出するためにNBT / BCIPで腎臓を治療します。 4％パラホルムアルデヒドで腎臓を修正し、レモするジメチルホルムアミド中でインキュベート脱イオン水に一晩漂白、過剰NBT / BCIP VEの。腎臓を洗浄した後、カバーガラス下で50％グリセロールでPBSTで撮影。

結果

ゲンタマイシン損傷は水に腎上皮キャストの観察（ 図1）によって視覚的に確認することができます。ゲンタマイシンの異なる投与量は、再生腎臓（ - D図1A）にlhx1a +細胞凝集体の数を増加させることで、その結果、成体野生型TuABゼブラフィッシュを傷つけるために使用されました。ホワイトキャストが容易に損傷後の水1日（ - H図1E）で見ること?...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、大人の中腎腎臓⁶を含む成人の臓器の再生を研究するための理想的です。最近の研究では、より良いネフロンの再生中に発生するステップを特徴づけるために分子マーカーと新しいトランスジェニックレポーターラインを利用しているとどのような細胞が^7,12責任を負うことがあります。尿円柱の観察は、ヒト¹⁶における腎疾患を診断するために一...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution