Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

Zusammenfassung

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Zusammenfassung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Einleitung

Die Niere ist für die Flüssigkeit Homöostase, Blutdruckregulation und Filtration von Abfall aus dem Körper. Obwohl Säugetiere sind in der Lage, bestehende Nephrone nach Verletzung mit differenzierten Epithelzellen ^1-4 reparieren, scheinen sie einen Pool von reservierten Stammzellen ⁵ fehlt und sind unfähig, neue Nephrone de novo bilden. Im Gegensatz zu Säugetieren, sind erwachsene Fische können neue Nephronen während des Erwachsenenlebens zu bilden, um das Wachstum der Fische und in Reaktion auf eine Verletzung ^6,7 unterstützen. Der Zebrafisch, Danio rerio, ist ein unschätzbares Modellorganismus für das Studium der Organregeneration ^8-10 und hat das Potenzial, leistungsstarke Einblicke in die Anwendungen für Engineering der Reparatur von menschlichen Nieren zu schaffen. Die Tg (Lhx1a: EGFP) Transgen ¹¹ ist gezeigt worden, um einen Pool von Nephron-Vorläuferzellen im erwachsenen Zebrafisch Nieren ¹² kennzeichnen jedoch Mechanismen, die die Reaktion der lhx1a + Zellen verletzungs rEmain unklar.

Das Aminoglycosid Gentamicin ist ein häufig verwendetes Antibiotikum mit bekannten nephrotoxischen und ototoxic Wirkungen bei Menschen ^13. Intraperitoneale Injektion von Gentamicin ist ein etabliertes Verfahren zur Induktion der akuten Nierenschädigung in Fisch ^6. Diese Verletzung in Fisch imitiert den Verlust von Tubulusepithel und Vernarbung der Glomeruli, die nach Gentamicin ¹⁴ Dosierung beim Menschen auftritt. Induzieren Schädigung im Zebrafisch Refobacin Injektion ist ein bequemer Weg induzieren eine starke, synchrone Regenerierung Reaktion mit vielen neuen Nephronen erzeugt und gleichzeitig durch die Stufen der Bildung, Proliferation und Differenzierung fortfahren.

Dieses Protokoll Details unserer Verfahren für robuste und reproduzierbare Verletzung im erwachsenen Zebrafisch Niere durch die Verwendung eines nicht-invasiven bild Screening-Prozess, um Ausreißer zu minimieren. Wir nutzen die Tatsache, dass Verletzungen mit Gentamicin führt zum Tod von epithelialen Nierengewebe und FormatIon der Nierentubuli Abgüsse, die dann in Massen sammeln sich in den Mesonephros Kanäle und Kloake. Diese werden durch den Fisch geführt und kann visuell im Wasser beobachtet werden. Dies erlaubt uns, für Fische mit stark nicht-tödliche Verletzungen, die dann für weitere Experimente gebündelt werden können screenen. Minimierung der Zahl der unverletzten Fische oder Fische, die vor Erreichen der Endpunkt des Experiments führt zu mehr einheitliche und effiziente Datenerfassung und -analyse zu sterben. Darüber hinaus sind keine speziellen Geräte oder Reagenzien erforderlich, so dass diese Verfahren kostengünstiger und geeigneter für die Verwendung in einem akademischen oder Lehr Einstellung. Mit unserem Verfahren, hier zeigen wir die zunehmenden Auswirkungen von Gentamicin-Dosis auf die Nierenregeneration sowie die Wirkung der erhöhten Temperatur.

Protokoll

HINWEIS: Ethics Statement: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Massachusetts General Hospital Richtlinien für Tierversuche in der Forschung durchgeführt.

1. Voraus Vorbereitung

1. Ermitteln Sie, wie viele erwachsenen Zebrafisch 6-12 Monate alt, um zu verletzen. Plan, um 10-20% mehr Fische als benötigt zu verletzen. Um Schwankungen zu minimieren, abgestimmte Einsatz Alter Geschwister Fische in der gleichen Tank gemeinsam aufgezogen, so dass sie ungefähr die gleiche Größe und weniger genetische Variabilität. Weiblichen Fische sind viel einfacher zu injizieren, verglichen mit dem männlichen Fische aufgrund der größeren Kapazität des Bauches. , Männchen und Weibchen geben jedoch ähnliche Ergebnisse.
2. Wenn dabei den Versuch zum ersten Mal, eine Dosiskurve zu zeichnen, um die geeignete Dosierung für ein Gentamycin spezifischen Stammes von Fisch zu bestimmen. Testen jeder neuen Charge von Gentamicin vor der Verwendung in Experimenten, da die Reinheit des Gentamicin variiert von Charge zu Charge. Die richtige Dosierung sollte durch die Bewertung expressi bestimmt werdenauf Verletzungsmarker wie lhx1a. (Siehe 1A - D).
3. Bereiten Gentamicin-Lösung. Gentamicin-Stammlösung kann in -20 ° C gelagert und zur späteren Verwendung aufgetaut werden. Zum Beispiel für eine 80 mg / kg-Dosis (80 mg Gentamicin / kg Körpergewicht) in einem Fisch einem Gewicht von 0,5 g, herzustellen 2 mg / ml Gentamycin in phosphatgepufferter Salzlösung als eine bequeme Arbeitslösung. Dies stellt eine 20 ul Gentamycin zur intraperitonealen Injektion in den Fisch.
   HINWEIS: In der Regel 80 bis 120 mg / kg erzielen gute Ergebnisse, aber so geringen Dosen wie 40 mg / kg geeignet sein. Gentamicin kann auch in Lösung erworben werden, um die Exposition gegenüber gefährlichen Laborpersonal zu minimieren.
   HINWEIS: Gentamicin in hohen Dosen giftig sein können. Tragen Sie Handschuhe und Maske bei einem Gewicht von Pulver.
4. Bereiten Sie 100 ml von 0,016% Tricaine Wasser für Anästhesie Fisch. Bereiten Sie eine Bestandsaufnahme 25x Tricaine (4 g / 1 L) in sterilem Milli-Q-Wasser gelöst, auf pH 7 und bei 4 ° C bis zur Verwendung. Verdünnen Sie 4 ml in 100 ml Wasser für Fisch einer Arbeitskonzentration von 0,016%.
   HINWEIS: Tricaine ist ein Anästhetikum und hautreizend, Handschuhe bei der Handhabung.
5. Machen Sie einen Fisch aus einem Kunststofftransferpipette schöpfen, indem die Lampe in Form einer Kugel und Schneid 2 Steckplätze in den Boden, das Wasser abgeleitet. Last 1 ml Spritzen (mit 10 ul Abstufungen) mit der vorbereiteten Lösung Gentamicin und fügen Sie eine 30½ G Nadel. Entfernen Sie alle Luftblasen. Drehen Sie die Nadel auf die Spritze, um sicherzustellen, dass die gebogene Spitze auf der Nadel abgewandten und die Spritze Markierungen nach vorne und lesbar. Für Steuereinspritzungen, bereiten eine Spritze und Nadel mit sterilem PBS.
6. Bereiten Sie eine Skala mit einer sauberen Oberfläche oder wiegen Boot sowie Papierhandtücher zum Trocknen von Fisch und zum Halten von Fisch für die Injektion.
7. Bereiten einzelnen kleinen Halbliter-Behälter mit Deckel zur Aufnahme von Fisch zur Beobachtung über Nacht nach der Injektion. Kleinen transparenten Kunststoff Führungskäfige sind für diesen Zweck nützlich. DieseBehälter nicht weiß - im Idealfall sollten sie klar sein, so dass die weißen epithelialen Abgüsse von den Fischschuppen auf einem schwarzen Tischplatte beachten. Füllen Sie jeden Container mit genug Fisch Wasser für die Fische, um bequem zu schwimmen.

2. intraperitoneale Injektion von Gentamicin

1. Betäuben die Fische in 0,016% Tricaine Lösung in Fischwasser. Warten Sie auf den Kiemenventilationsrate zu verlangsamen und die Fische nicht mehr auf Berührung reagieren.
2. Schöpfen die Fische mit dem Fisch Schaufel, sich von Kopf zu Schwanz, um nicht zu verletzen, die Kiemen oder Flossen. Den Fisch auf Küchenpapier, um das überschüssige Wasser durch Drehen der Fisch aus sanft auf die Seite aufnehmen und schütteln Sie überschüssiges Wasser aus der Schaufel.
3. Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie in die wiegen Boot auf der Skala auf Null gestellt und wiegen die Fische. Runde auf den nächsten 0,25 g, und berechnen Sie die entsprechende Menge an Gentamicin zu injizieren.
   HINWEIS: Für eine 0,5 g Fisch mit einem 20 & mgr; l Injektion in 80 mg / kg-Dosis.
4. Schöpfen die Fische wieder und legen Sie sie auf einer trockenen gefalteten Papiertuch. Wenn die Injektion mit der rechten Hand den Papiertuch in der linken Hand und legen Sie den Kopf des Fisches nach links, mit der Bauch leicht zugänglich.
5. Halten Sie die Spritze mit der Nadel in einem 45 ° Winkel auf die Haut des Bauches, anterior der Kloake. Drücken Sie die Nadel unter die Haut, dann den Winkel zu verringern, und schieben Sie die Nadel nach vorne unter die Haut, die Vermeidung der inneren Organe. Drücken Sie den Kolben der entsprechenden Menge, innehalten, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit kommt heraus um die Nadel, dann ziehen Sie die Nadel. Wenn die Fische halten stetigen ist ein Problem, Klammer Ellbogen Oberkörper, um sie zu stabilisieren.
   HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Gentamicin-Lösung.
6. Drop jeden Fisch zu einem individuellen Behälter. Beobachten Sie die Fische und deren Verwertung aus der Narkose. Halten Fisch bei 28,5 ° C über Nacht.
   HINWEIS: Wenn die Fische nicht sofort wieder zu beleben, mit einem Kunststoff-transfer-Pipette, um Wasser zu bewässern über die Kiemen, um es wieder zu beleben.
7. Verwenden Sie die gleiche Spritze und Nadel bei der Injektion mehrere Fische mit der gleichen Dosis von Gentamicin. Entsorgen Sie die Spritze und Nadel in die entsprechende Biohazard Behälter für spitze Gegenstände.

3. Nacheinspritzung Beobachtung der Verletzungen

1. Am nächsten Tag (1 Tag nach der Verletzung), legen Sie die injizierten Fische in ihrem Behälter auf einer dunklen Oberfläche. Weiß Abgüsse von Toten Epithelgewebe von den verletzten Fisch ausgeschieden sollte sichtbar sein. (Siehe Abbildung 1 E - H). Wenn es keine Zylinder entweder der Fisch nicht durch die Gentamicin Injektion verletzt (entweder die Dosierung zu niedrig, oder einige der Gentamicin während des Spritzvorgangs ausgetretene) oder der Fisch wurde ernsthaft verletzt zu einer vollständigen Blockierung der Harnleiter und Kloake mit abgestoßen Gewebe.
   HINWEIS: Wenn die Fische nicht in der Lage, um die Abgüsse vom Körper es in der Regel innerhalb von 2-3 Tagen sterben, zu löschen und damit unbrauchbar für längereAssays. Wenn keine Zylinder sichtbar sind, einschläfern die Fische in Tricaine Wasser für mindestens 10 min eingetaucht, nachdem gill Bewegung stoppt.
2. Wenn weißes Seiden Abgüsse sichtbar sind, stellen Sie den Fisch beiseite und weiterhin die Überprüfung der anderen Fischen. Eine geeignete Dosis von Gentamicin in 80-90% der Fische wobei brauchbaren Ergebnis. Pool des verletzten Fisch und dann teilen sie in verschiedene Behandlungsgruppen, falls gewünscht.

4. Pflege von Einholen von Fisch

1. Halten Fische in sauberes Wasser und menschenleeren Umgebung. Schmutzwasser und Gedränge wird, um Infektionen und ungewollten Tod führen. Versuchen Sie, nicht mehr als 6 Fisch / 500 ml Fisch Wasser täglich, wenn möglich zu halten und das Wasser wechseln.
   Anmerkung: Dies ist ein Minimalvolumen für die Konservierung der Raum oder der Prüfer wünscht Experimente mit teuren Arzneimittelbehandlungen durchzuführen.
2. Haben die Fische zu füttern nicht bis 3 Tage nach der Verletzung. Einholen von Fisch wird zunächst nicht zu essen, und alle Lebensmittel in den Tank zersetzt und fördern Bakterien growth. Ab 3 Tage nach der Verletzung, füttern Sie eine kleine Menge einmal täglich.

5. Analyse der Verletzte Nieren

1. Für in-situ-Hybridisierung für lhx1a mRNA-Expression kann Nieren von Fisch in gewünschten Zeitpunkten geerntet werden. Euthanize Fisch in Tricaine Wasser auf Eis mindestens 10 min bis gill Bewegung stoppt, entfernen Sie dann den Kopf mit einer Rasierklinge und öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie die inneren Organe mit einer Pinzette.
2. Verlassen Sie die Niere statt (pigmentierte Orgel an der dorsalen Körperwand befestigt) und befestigen Sie den Fisch in 4% Paraformaldehyd in PBS über Nacht. Sezieren die Niere ¹⁵ und fahren Sie mit Standard-in-situ-Hybridisierung.
   1. Kurz gesagt, wasche die Nieren in PBST (phosphatgepufferte Salzlösung 0,5% Tween 20), mit Proteinase K in PBST (10 ug / ml) für 1 h bei Raumtemperatur permeabilisiert. Post-fix mit 4% Paraformaldehyd und mit PBST gewaschen.
   2. Dann vorge hybridisieren die Nieren über Nacht bei 68; ° C in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 5 × SSC, 50 ug / ml Heparin, 500 ug / ml tRNA, 0,1% Tween20, pH 6,0).
   3. Die Proben mit Digoxigenin markierten Sonde in Hybridisierungspuffer inkubieren, dann für 5-10 min waschen mit je 100%, 75%, 50%, 25% Hybridisierungspuffer bei 68 ° C, dann in Raumtemperatur und zweimal Waschen für 30 min mit 2 × SSC mit 0,1% Tween 20, und waschen zweimal für 30 min mit 0,2 × SSC mit 0,1% Tween20.
   4. Äquilibrieren die Probe 3x 5 min in MAB (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5) gewaschen und über Nacht bei 4 ° C in MAB mit 10% Ziegenserum blockiert. Dann inkubieren Proben über Nacht in Anti-Digoxigenin-AP Fab 1: 5.000 in MAB.
   5. Für 1 h in MAB wasche die Probe 5x und äquilibrieren 3x 15 min in NTMT (0,1 M Tris pH 9,5, 0,05 M MgCl _2, 0,01 M NaCl, 50 & mgr; l Tween 20).
   6. Dann behandeln die Nieren mit NBT / BCIP zu Signal zu erfassen. Befestigen Sie die Nieren mit 4% Paraformaldehyd und in Dimethylformamid inkubiert, um remove überschüssige NBT / BCIP, über Nacht in entionisiertem Wasser gebleicht. Waschen Sie die Nieren und dann in PBST fotografieren mit 50% Glycerin unter einem Deckglas.

Ergebnisse

Gentamicin Verletzung kann visuell durch Beobachtung der Nierenepithelzellen Abgüsse im Wasser (1) bestätigt werden. Verschiedene Dosierungen von Gentamicin wurden verwendet, um erwachsenen Wildtyp TuAB Zebrafisch zu verletzen, was zu immer mehr lhx1a + Zellaggregaten in der regenerierenden Nieren (1A - D). Weiß Abgüsse können leicht in das Wasser 1 Tag nach Verletzung (- H 1E) zu sehen. Eine geringe Dosis von Gentamicin in Folge die meist...

Diskussion

Der Zebrafisch ist ideal für das Studium der Regeneration von erwachsenen Organen, einschließlich der erwachsenen Niere Mesonephros ^6. Jüngste Studien haben den Vorteil von molekularen Markern und neuen transgenen Reporter Linien besser zu charakterisieren die Schritte, die während Nephron Regeneration auftreten und welche Zellen verantwortlich ^7,12 sein könnten. Beobachtung Harnzylinder ist seit über einem Jahrhundert verwendet, um Nierenerkrankungen beim Menschen ¹⁶ zu diagnostiz...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
gentamicin sodium sulfate	Sigma	G1264	TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets	Fisher	13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes	Electron Microscopy Sciences	72520	green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles	Becton Dickinson	305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)	Sigma	A5040	IRRITANT
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Make 4% in 1x PBS for working solution