تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Summary

زراعة قوقعة (CIS) تمكين السمع بواسطة التنبيه الكهربائي المباشر من العصب السمعي. ومع ذلك، وضعف وتيرة وشدة قرار يحد من جودة السمع مع رابطة الدول المستقلة. نحن هنا وصف optogenetic تحفيز العصب السمعي في الفئران باعتبارها استراتيجية بديلة للبحث السمعي وتطوير التهيئة المستقبلية.

Abstract

التحفيز الكهربائي المباشر من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية (SGNs) من خلال زراعة قوقعة (CIS) يتيح الفهم خطاب مفتوح في غالبية المواضيع صماء مزروع ^{1- 6.} ومع ذلك، ترميز الصوت مع التهيئة الحالية لديه ضعف وتيرة وشدة قرار بسبب انتشار واسع الحالي من كل اتصال القطب تفعيل عدد كبير من SGNs على طول محور التوضع النغمي من القوقعة ^{7- 9.} ويقترح التحفيز البصري كبديل لالتحفيز الكهربائي الذي يعد أكثر مكانيا تنحصر تفعيل SGNs، وبالتالي، قرار تردد أعلى من الترميز. في السنوات الأخيرة، وقد استخدمت الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء مباشرة من القوقعة لاستحضار الردود في العصب السمعي ^10. ومع ذلك فإنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي ^10،11 وعدم اليقين لا يزال لآلية الكامنة ^12. نحن هنا تصف طريقة استنادا optogenetics لتحفيز SGNsمع كثافة منخفضة الضوء الأزرق، وذلك باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير العصبية من channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ أو التعبير بوساطة فيروس من قبض ChR2-البديل ^14. كنا ضوء الصغير الثنائيات (μLEDs) وأشعة الليزر، بالإضافة إلى تحفيز ألياف SGNs، معربا عن ChR2 من خلال فتحة صغيرة الاصطناعي (فغر القوقعة) أو إطار جولة. نحن يعاير ردود التسجيلات فروة الرأس من إمكانات أثار ضوئية (optogenetic استجابة الدماغ السمعية: oABR) أو عن طريق التسجيلات مسرى مكروي من المسار السمعي وقارنوها مع التحفيز الصوتية والكهربائية.

Introduction

وفقا لمنظمة الصحة العالمية، 360 مليون شخص في العالم يعانون من فقدان السمع. في موضوعات صماء، التحفيز الكهربائي المباشر للSGNs بواسطة التهيئة تمكين الفهم خطاب مفتوح في أغلبيتهم ^1،2،4،5. على الرغم من التهيئة تم زرعها في أكثر من 200،000 شخص، وبالتالي كونها neuroprosthesis أنجح، ترميز الصوت مدفوعا زراعة قوقعة الحالية محدودة. تستند التهيئة على التحفيز الكهربائي من قبل عدد معين من الأقطاب الكهربائية حيث كل واحد ينشط منطقة التوضع النغمي من العصب السمعي وبالتالي تجاوز الجهاز الحسي مختلة كورتي في القوقعة. يمكن المستمعين السمع يميز أكثر من 2،000 الترددات، لكن استخدام عناصر التهيئة اليوم فقط ما يصل الى 12-22 تردد القنوات ^4. هذا يرجع إلى تدفق التيار الكهربائي على نطاق واسع من كل ^7،9 تحفيز وتفعيل عدد كبير من SGNs التي تمثل العديد من الترددات الصوتية المختلفة ^8،15. هذايمكن تحسين الحد باستخدام التحفيز متعدد الأقطاب ولكن على حساب زيادة استهلاك الطاقة ^16،17. على النطاق الديناميكي الناتج عن شدة الصوت محدودة أيضا، وعادة أقل من ^4،18 ديسيبل 6-20. لهذه الأسباب، وتحسين وتيرة وشدة قرار هي أهداف هامة لزيادة أداء CI لتحسين التعرف على الكلام في البيئات الصاخبة، فهم علم العروض والموسيقى التصور.

وثمة خيار آخر لتحفيز العصب السمعي هو التحفيز البصري. الضوء يمكن أن تركز بشكل ملائم لاستهداف السكان SGN صغير، واعدا الحبس المكاني أفضل، وزيادة وتيرة وأيضا قرار توسيع النطاق الديناميكي، مما أدى إلى قرار كثافة أفضل. في الواقع، أظهرت التحفيز القوقعي مع ضوء الأشعة تحت الحمراء قرار تردد ممتازة في النماذج الحيوانية ^10،11،19. ومن عيوب هذا النوع من التحفيز هو أنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي ^{و10،11. وعلاوة على ذلك، أثيرت مخاوف بشأن قدرة طريقة لتحفيز الخلايا العصبية السمعية 12،20 مباشرة.}

كبديل لتحفيز الأشعة تحت الحمراء، ونحن توظيف optogenetics لتقديم SGNs ضوء حساسية. Optogenetics هو النهج الجديد الذي يجمع بين التقنيات الوراثية والبصرية لغير جراحية وتحديدا السيطرة على الخلايا بدقة عالية الزمنية (مراجعات ^{21- 23).} طريقة حاليا الأكثر استخداما توظف التعبير عن الميكروبي channelrhodopsin 2 (ChR2) الجين من كلاميدوموناس reinhardtii ومتغيراتها، ترميز قناة الموجبة بوابات الخفيفة ^24. ChR2 هو بروتين 7 عبر الغشاء الحلزوني أنه عندما transduced في الخلايا العصبية وتفعيلها من خلال الضوء الأزرق، تعمل قناة الموجبة وغير انتقائية، وبالتالي إزالة إستقطاب الخلايا ^{24- 27.} تم ChR2 تتميز كذلك ^{24،28- 31} و وقد وضعت العديد من المتغيرات لتعديل التدبير العمومين الطيف، النابضة ونفاذية خصائص ^32،33. والهدف من عملنا هو إنشاء optogenetics القوقعة لتفعيل المسار السمعي. نلاحظ أن النهج optogenetic لتحفيز العصب السمعي يتطلب التلاعب الجيني للالعقدة الحلزونية للتعبير عن channelrhodopsin. العمل مع الفئران والجرذان يسمح باستخدام حيوانات معدلة وراثيا المتاحة ^13،34،35، والتي توفر التعبير عن channelrhodopsin مع تقلب قليلا على طول محور التوضع النغمي وعبر الحيوانات ^36. الجمع بين الأليلات الشرطية المناسبة مع ³⁷ لجنة المساواة العرقية خطوط يوفر للتعبير عن خلية محددة. نقل الجينات إلى العقدة دوامة من الحيوانات الأخرى يتطلب استخدام فيروس مثل فيروس الغدة المرتبطة وهذا هو نهج موحد في optogenetics ³⁸ وأننا أظهرنا للعمل بشكل جيد في الفئران ^36. التلاعب الجيني والتعبير عن الجينات المحورة ترميز البروتينات الغريبة المخاطر الدب الآثار الضارة مثل immuردود شمال شرق و / أو انتشار، حالة خطر أو حتى موت خلايا التلاعب وراثيا. لغرض هذه المظاهرة نستخدم الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 الخلايا العصبية في العقدة الحلزونية تحت PROMOTOR خاصتك-1 ¹³ إلى تحفيز بصريا المسار السمعي. نلاحظ أن المتغيرات channelrhodopsin أخرى يمكن استخدامها لنفس الغرض كما أثبتنا باستخدام نقل الفيروس بوساطة من الصيد البديل ¹⁴ إلى ³⁹ SGNs.

بينما optogenetics القوقعة يتطلب التلاعب الجيني، فإنه يوفر ضبط الجزيئي لتحسين SGN التحفيز والوعود تحسين تواتر وشدة قرار بالمقارنة مع التحفيز الكهربائي. التحفيز Optogenetic من المسار السمعي هو ذات الصلة للغاية لأبحاث السمع. على سبيل المثال، يعد التقدم في دراسات صقل تعتمد على النشاط tonotopy من خلال التنمية، في تحليل متطلبات الاندماج الطيفي في localizat الصوتايون ومدى التفاعل بين التوقعات تردد محدد وارد في النظام السمعي المركزي.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي قدمت في هذا العمل مع المعايير الأخلاقية التي يحددها القانون الألماني لحماية حيوانات التجارب. وافق مجلس جامعة غوتنغن لرعاية الحيوان والرفق بالحيوان مكتب ولاية ساكسونيا السفلى التجارب.

1. إعداد μLED-مشجعا

1. لμLEDs، وإعداد للمشجعا μLED أولا. استخدام المصابيح الزرقاء مع 200 من 200 ميكرون السطح النشط (μLED، انظر الجدول المواد).
2. أسلاك لحام إلى μLED. ثم، تغليف μLED والاتصالات باستخدام الغراء الايبوكسي. ترك بين عشية وضحاها جهاز للسماح للعلاج الايبوكسي.
3. لتحقيق الاستقرار الميكانيكية والعزل الكهربائي بضخ الأسلاك من خلال الزجاج الشعرية رقيقة، استخدم 1 ملم القطر الخارجي البورسليكات الشعيرات الدموية وختم تقاطع مع الايبوكسي (الشكل 1D) بحيث الشعرية يمكن تركيبه على مناور الميكانيكية.
   ملاحظة: Tهنا هو مفاضلة جعل كبسولة سميكة بما فيه الكفاية للحصول على العزل الكهربائي جيدة (تجنب القطع الأثرية التحفيز)، ولكن رقيقة بما فيه الكفاية للسماح للLED التحرك بحرية داخل الفقاعة، وتحديد موقعه على فغر القوقعة. وهو ممارسة جيدة لإعداد LED أكثر من واحد.
4. لتأكيد العزل الكهربائية جيدة، وإعداد أول طبق بتري مع كلوريد الصوديوم 0.9٪ وتراجع 3 العارية الأسلاك النحاسية انتهت في السائل. هذا يعمل على محاكاة حيوان مع أقطاب ABR. ربط الأسلاك إلى ABR مكبر للصوت ومن هناك إلى الذبذبات.
5. بعد ذلك، ربط LED للمشجعا وتزج به إلى الحل حتى يتم تغطيتها تماما. محرك الصمام مع البقول (راجع الخطوة 3.1.1) في الحد الأقصى المسموح به التيار لمدة أطول من 20 دقيقة والتحقق من وجود القطع الأثرية التحفيز. إذا ظهورها، تجاهل LED ومحاولة واحدة جديدة.

2. الإجراء الجراحي

1. استخدام 4-10 أسابيع من العمر الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 تحت المروج Thy1.2 (خط 9في وانغ وآخرون ^13). لمعالجة الحيوان وإجراء الجراحة، دائما استخدام أدوات جراحية نظيفة والمحددة جيدا.
2. تخدير الحيوانات مع حقنة الملكية الفكرية من خليط من يوريتان (1.32 ملغ / كلغ)، زيلازين (5 ملغ / كلغ)، والبوبرينورفين 0.1 ميكروغرام / غرام مخففة في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم المعقم ووضع الماوس على لوحة التدفئة للحفاظ على الجسم درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. مع هذه الجرعة، والتخدير وعادة ما يستمر لمدة البروتوكول التجريبي كله.
   1. تبدأ في 10 دقيقة بعد الاختيار الأولي تحريض التخدير عن علامات الإثارة التي لا ارادي مخلب الانسحاب. في حالة الحركات، وتطبيق جرعات صيانة يوريتان (0.66 ملغ / كلغ) والبوبرينورفين (0.05 ميكروغرام / غرام) المخفف في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم المعقم (بدون زيلازين). التحقق مرة أخرى منعكس مخلب الانسحاب والمضي قدما إلا إذا كان رد الفعل غائب.
3. حلاقة بعناية المنطقة خلف الأذن في إعداد شق. استخدام خلف الأذنالاقتراب للوصول إلى الفقاعة (تجويف الأذن الوسطى التي تحتوي على الهواء).
   1. مع ملقط تشريح الصغرى بعناية و / أو إزالة جزء من عضلات الرقبة، على سبيل المثال، لل platysma، القصية الترقوية الخشائية، وscalenes.
   2. البحث وفضح الفقاعة (الشكل 1A). تحديد الفقاعة كهيكل عظمي مع الشكل الكروي المميز مع عصابة على سطح الفقاعة التي تشير إلى الإدراج في الغشاء الطبلي (الشكل 1A). جعل ثقب مع غيض من إبرة الأنسولين فقط دون هذه الحلبة. تبدأ هناك، وإزالة العظام التي تغطي الفقاعة مع مقراض غرامة (القضام) أو microforceps في مثل هذه الطريقة أن الطنف من القوقعة يتعرض (الشكل 1B).
4. لفغر القوقعة، حلاقة بلطف قبالة كبسولة عظمية لفتح نافذة صغيرة (فغر القوقعة: ~ 500-800 ميكرون)، مع الحرص على ترك سليمة والتيه الغشائي (الشكل 1B). إجراء فغر القوقعة على القوقعة الثانيةبدوره كما هو الآن ما يكفي من الشريان الركابي ومن قمة. يمكن فتح ذروة إنتاج تمزق القوقعة بما في ذلك كسر في عماد القوقعة.
5. لنافذة الإدراج جولة من الألياف البصرية أو μLED-الزرع إلى السقالة الطبلية، تكبير بعناية النافذة المستديرة المتخصصة التي كتبها خدش مكانة عظمي مع غيض من مشرط حاد (شفرة رقم 11 هو خيار جيد). دائما استخدام شفرة جديدة أو مشرط. نكون حذرين للغاية كما يعمل الشريان الركابي قريب جدا من نافذة مستديرة (الشكل 1B).

3. البصرية عن طريق تحفيز نهجين

1. لتحفيز transcochlear، μLEDs أو الألياف إلى جانب استخدام الليزر.
   1. جبل الشعرية تحمل μLED على مناور الميكانيكية وبعناية وضع μLED على فغر القوقعة. استخدام oABR، التي تسببها 3-10 التحفيز طويلة مللي ثانية من مصدر الحالي (عادة 5-40 مللي أمبير في 2.7 V) في 1-5 هرتز، كوسيلة لتحسين الموقف وأوientation من μLED.
   2. لتحفيز الليزر، واستخدام 473 نانومتر المستمر موجة الليزر والألياف البصرية 250 ميكرون (انظر المواد). زوجين الألياف البصرية إلى مصدر الليزر الأزرق الذي يقدم مثالي السيطرة التناظرية سريعة من الطاقة (آخر استخدام جهاز صوتية أو بصرية أو مصراع سريع لتحديد التحفيز البصري). باستخدام مياداة مجهرية، موقع غيض من الألياف مباشرة على فغر القوقعة وإصلاحه هناك باستخدام الاسمنت الأسنان (التحفيز transcochlear).
2. لتحفيز intracochlear، إدراج الألياف من خلال النافذة المستديرة في طبلة الأذن سكالا. ثم استخدم 3-10 نبضات الليزر ميللي ثانية من 10-30 ميغاواط (قوة الانتاج الألياف) في 1-5 هرتز للحصول oABR. سعة كبيرة من oABR تمكن المجرب لمراقبة oABR التي حركها المحفزات واحدة على الذبذبات لتحسين الموقف والتوجه للباعث (μLED أو الألياف) باستخدام oABR السعة باعتبارها من القراءة.
3. متى تحققت oABR جيدة، وتحديد الألياف مع cyanoacrylate الغراء أو الأسمنت الأسنان والانتظار حتى الغراء الصلبة.
   ملاحظة: فمن الطبيعي أن نلاحظ بعض السائل الخروج من القوقعة. ومع ذلك لتجنب المشاكل مع البلمرة من الأسمنت، فإنه من المستحسن أن تجف المنطقة باستخدام الفتائل القطن غرامة.

4. تسجيلات oABR

1. إدراج أقطاب الإبرة تحت الصيوان، على قمة الرأس وعلى الظهر بالقرب من الساقين وربطها مكبر للصوت.
2. تضخيم إمكانات الفرق بين قمة الرأس وإبر تحت الجلد الخشاء. عينة بمعدل 50 كيلوهرتز و فلتر (1-10،000 هرتز). تصور إمكانية الاختلاف على الذبذبات مثالي بالقرب من الإعداد الأمثل لتسجيل موقف مشجعا البصرية. استخدام إشارة المتوسط ​​(50-1،000x) وتخزين البيانات على الكمبيوتر للتحليل غير متصل.

5. تسجيلات من إمكانات بصريا مستدعى الميدانية المحلية

1. وضع الحيوان في إطار المجسم. باستخدام ملقط المائةمسيرة سحب الجلد المغطي الجمجمة وإجراء شق متوسط ​​مع مقص تمتد تقريبا من بين العينين إلى النقطة التي نعلق عضلات الرقبة إلى الجمجمة.
   1. يعكس الجلد أفقيا. قطع السمحاق طوليا على طول الدرز السهمي وإزالته sideward عن طريق فرك بلطف عظم الجمجمة يتعرض مع مسحة القطن.
2. وضع لوحة معدنية العرف على الجمجمة يتعرض ترك حوالي 1 مم الفضاء بين نهاية الذيلية من لوحة وامدا. مع 0.7 مم حفر بعناية حفر حفرة في العظم الجداري.
3. المسمار بلطف في 0.85 ملم قطر المسمار - لتكون بمثابة مرجعية لإمكانات المسجلة من أكيمة السفلي (IC) - عقد المسمار مع ملقط طالما لا المسمار تثبيتها بشكل آمن. ضمان اتصالات جيدة بين المسمار والجافية دون اختراق الدماغ. الغراء والمسمار لوحة معدنية على الجمجمة مع الغراء cyanoacrylate.
4. تخفيف نإيك العضلات بلطف من الجمجمة. سحب عضلات الرقبة نحو caudally لحوالي 1-2 ملم. تحديد تقاطع الجيوب الأنفية متفوقة سهمي (SSS) والجيوب الأنفية عرضية (TS). إذا لزم الأمر، وزيادة الشفافية في الجمجمة بواسطة تبليل العظام بمحلول كلوريد الصوديوم الفسيولوجية.
   1. تحديد IC في الفئران والكذب الذيلية مباشرة إلى نظام الضمان الاجتماعي وTS التقاطع. بعد تحديد موقع IC ببطء وبعناية إجراء حوالي نقب تمديد 0.5 ملم إلى 1.5 ملم rostrally نحو caudally إلى TS وحوالي 3 ملم أفقيا.
   2. تجنب أية إصابة في نظام الضمان الاجتماعي وTS لأن هذه من شأنه أن يحول دون تجربة ناجحة. هنا، واختبار ما إذا كانت العظام trepanned أصبحت فضفاضة التي دفعت به بهدوء. باستخدام ملقط رفع ببطء قبالة العظام.
5. مع محول مناسب إرفاق مجموعة متعددة وheadstage الصعود إلى مياداة مجهرية. لمنع تدمير مجموعة تسجيل الأقنية خلال الإدراج في IC، بعناية إزالة الجافيةمع طرف عازمة إبرة تحت الجلد صغيرة بدأت قريب من حافة العظام.
   1. إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي. إصلاح لوحة معدنية على شريط البقاء تثبيت التجسيمي. وضع المسبار تسجيل على IC وأدخلها تحت السيطرة المجهرية مثل أن أعلى معظم قناة مرئيا فقط على السطح.
6. تضخيم إمكانات الفرق بين القنوات الفردية للمجموعة تسجيل والمسمار إشارة في العظم الجداري، عينة بمعدل 32 كيلو هرتز، مرشح تمرير منخفض (300 هرتز) وتخزينها على جهاز كمبيوتر لتحليل غير متصل.
7. كل الحيوانات يجب أن يتم التخلص إنسانية في نهاية الإجراء قبل الاستعادة مخدر وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة القتل الرحيم. قد تتضمن أساليب مناسبة من القتل الرحيم خلع عنق الرحم أو CO ₂ الاستنشاق.

النتائج

وفغر القوقعة الأمثل أمر بالغ الأهمية ويزيد من احتمال وجود تجربة ناجحة، وهذا يعني أن الإطار النظامي، صغيرة، وليس هناك إصابة الهياكل قوقعة الأذن الداخلية. على سبيل المثال، يشير النزيف الضرر للعائي السطر. ويرد مثال جيد في الشكل 1B.

Discussion

وصف التجارب تثبت التحفيز optogenetic من SGNs، ويمكن، من حيث المبدأ، يمكن استخدامه أيضا لتحفيز خلايا الشعر الداخلية و / أو الخارجية، قدمت التعبير عن opsins. هذه التجارب تتطلب الكثير من الصبر والرعاية. كما ذكر من قبل، الخطوات الأكثر أهمية هي جيدة فغر القوقعة / جولة نافذة الإدراج ف...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe