Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Zusammenfassung

Cochlea-Implantate (CI) ermöglichen durch direkte elektrische Stimulation des Hörnervs zu hören. , Schlechte Frequenz und Intensität Auflösung begrenzt jedoch die Qualität der mit CIs zu hören. Hier beschreiben wir optogenetische Stimulation des Hörnervs bei Mäusen als alternative Strategie für auditive Forschung und Entwicklung künftiger CIs.

Zusammenfassung

Direkten elektrischen Stimulation von Spiralganglienneuronen (SGNS) von Cochlea-Implantaten (CI) ermöglicht offenen Sprachverständnis in der Mehrzahl der Probanden implantiert taub ^1-6. Dennoch, Soundcodierung mit aktuellen CIs schlechte Frequenz und Intensität Auflösung durch breite aktuellen Verbreitung von jeder Elektrode Kontakt Aktivierung einer großen Anzahl von SGNS entlang der Achse tonotopen der Cochlea ^7-9. Optische Stimulation wird als Alternative zur elektrischen Stimulation, die räumlich begrenzt verspricht Aktivierung SGNS und damit höhere Frequenzauflösung der Codierung vorgeschlagen. In den letzten Jahren direkte Infrarotbeleuchtung der Cochlea wurde verwendet, um Reaktionen in der Hörnerv ¹⁰ hervorrufen. Dennoch höheren Energien erfordert als elektrische Stimulation ^10,11 und die Unsicherheit bleibt, wie auf den zugrunde liegenden Mechanismus ^12. Hier eine Methode, die auf Optogenetik zu stimulieren SGNS beschreiben wirmit geringer Intensität blaues Licht, mit transgenen Mäusen, die mit neuronalen Ausdruck Kanalrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ oder Virus-vermittelte Expression des ChR2-Variante Catch ^14. Wir verwendeten Mikro Leuchtdioden (μLEDs) und fasergekoppelte Laser zu ChR2-exprimierenden SGNS durch eine kleine künstliche Öffnung (Cochleostomie) oder das runde Fenster zu stimulieren. Wir untersucht die Reaktionen von Kopfhaut-Aufnahmen von Licht-evozierte Potentiale (optogenetische Hirnstamm-Reaktion: oABR) oder durch Mikroelektroden-Aufnahmen aus der Hörbahn und verglichen sie mit akustischer und elektrischer Stimulation.

Einleitung

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation, 360 Millionen Menschen weltweit leiden unter Hörverlust. In taub Themen, direkte elektrische Stimulation der SGNS von CIs ermöglichen offenen Sprachverständnis in den meisten von ihnen ^1,2,4,5. Auch wenn CIs wurden in mehr als 200.000 Menschen eingepflanzt worden, daher das erfolgreichste Neuroprothese, Sound-Kodierung durch die aktuellen Cochlea-Implantate angetrieben begrenzt. CIs auf elektrische Stimulation durch eine bestimmte Anzahl von Elektroden, wobei jede eine tonotopen Bereich des Gehörnervs unter Umgehung der dysfunktionellen sensorischen Corti-Organ in die Cochlea aktiviert basiert. Normalhörenden kann mehr als 2.000 Frequenzen zu unterscheiden, aber die heutigen CIs nur bis zu 12-22 ⁴ Frequenzkanäle. Dies ist aufgrund der weit verbreiteten Stromfluß von jeder Stimulationselektrode ^7,9, Aktivierung einer großen Anzahl von SGNS, die viele verschiedene Schallfrequenzen ^8,15 repräsentieren. DiesBegrenzung kann mit multipolaren Stimulation, aber auf Kosten einer höheren Leistungsaufnahme ^16,17 verbessert werden. Ihre Ausgangsdynamikbereich für Schallintensität ist auch begrenzt, in der Regel 6-20 dB unter ^4,18. Aus diesen Gründen, die Verbesserung der Häufigkeit und Intensität Auflösung sind wichtige Ziele für die Erhöhung CI Leistung der Spracherkennung in lauten Umgebungen, Prosodie Verständnis und Musikwahrnehmung zu verbessern.

Eine andere Möglichkeit, den Hörnerv stimulieren ist die optische Stimulation. Licht kann bequem ausgerichtet werden, um eine kleine SGN Bevölkerung zielen, und versprach bessere räumliche Begrenzung, die Erhöhung Frequenzauflösung und auch Dynamikbereich erweitert, was zu einer besseren Intensitätsauflösung. Tatsächlich hat Cochlea-Stimulation mit Infrarotlicht hervorragende Frequenzauflösung in Tiermodellen gezeigt, ^10,11,19. Ein Nachteil dieser Art der Stimulation ist, dass es höhere Energie als elektrische Stimulation erfordert ^{10,11. Darüber hinaus Bedenken über die Fähigkeit des Verfahrens, um direkt zu stimulieren akustischen Neuronen sind angehoben worden 12,20.}

Als Alternative zu Infrarot-Stimulation, beschäftigen wir Optogenetik zu machen SGNS lichtempfindlich. Optogenetik ist ein neuartiger Ansatz, der genetische und optische Techniken kombiniert, um nicht-invasiv und gezielt zu steuern Zellen mit hoher zeitlicher Genauigkeit ^(21-23 Bewertungen). Die derzeit am häufigsten verwendete Modalität verwendet, die Expression der mikrobiellen Kanalrhodopsin 2 (ChR2) Gen von Chlamydomonas reinhardtii und Varianten davon, ein lichtgesteuerter Kationenkanal ²⁴ kodiert. ChR2 ist ein 7-Trans-Helix-Protein, das, wenn es in Neuronen transduziert und durch blaues Licht aktiviert wird, wirkt als nicht-selektiven Kationenkanal, wodurch die Zellen depolarisierende ^{24 27.} ChR2 ist gut charakterisiert worden ^{24,28- 31} und vielen Varianten wurden entwickelt, um actio ändernn-Spektrum, Gate und Durchlässigkeitseigenschaften ^32,33. Das Ziel unserer Arbeit ist es, Cochlea-Optogenetik für die Aktivierung der Hörbahn zu etablieren. Wir stellen fest, dass die optogenetischen Ansatz für den Hörnerv stimulieren erfordert genetische Manipulation der Spiralganglien für die Expression von Kanalrhodopsin. Arbeiten mit Mäusen und Ratten erlaubt die Verwendung der verfügbaren transgenen Tiere ^13,34,35, welche die Expression des Kanalrhodopsin mit wenig Variabilität entlang der Achse und quer tonotopen Tiere ³⁶ bereitzustellen. Kombination bedingte Allele ³⁷ mit entsprechenden Cre-Linien sorgt für zellspezifische Expression. Gentransfer in die Spiralganglien von anderen Tieren erfordert die Verwendung von Viren wie Adeno-assoziierten Virus, das ein Standard-Ansatz in der Optogenetik ³⁸ ist, und dass wir zeigten in Mäusen ³⁶ gut zu funktionieren. Genetische Manipulation und Expression von Transgenen kodieren Proteine ​​Alien Bär Risiken für Nebenwirkungen wie IMMUne Reaktionen und / oder Proliferation, beeinträchtigt Zustand oder sogar zum Tod von genetisch manipulierten Zellen. Für den Zweck dieser Demonstration verwenden wir transgenen Mäusen, die ChR2 in Spiralganglienneuronen unter der Thy-1-Promotor ¹³ optisch stimulieren die Hörbahn. Wir stellen fest, dass andere Kanalrhodopsin Varianten können für den gleichen Zweck verwendet werden, wie wir mit Virus-vermittelte Übertragung der Variante Catch ¹⁴ in SGNS ³⁹ demonstriert.

Während Cochlea-Optogenetik erfordert genetische Manipulation, bietet es molekulare Tuning für optimierte SGN Stimulation und verspricht verbesserte Häufigkeit und Intensität Auflösung im Vergleich zu elektrischen Stimulation. Optogenetische Stimulation der Hörbahn ist für Gehörforschung von großer Bedeutung. Beispielsweise verspricht Verbesserungen in Studien des aktivitätsabhängigen Ausgestaltung Tonotopie während der Entwicklung in der Analyse der Anforderung für die spektrale Integration in Schall localizatIonen und des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen frequenzspezifischen afferenten Vorsprünge im zentralen auditorischen System.

Protokoll

Alle Versuche in dieser Arbeit vorgestellt wurden mit den ethischen Standards, die von der deutschen Gesetz zum Schutz von Versuchstieren durchgeführt definiert. Die Universität Göttingen Board für den Tierschutz und die Tierschutzstelle des Landes Niedersachsen hat den Experimenten.

1. Herstellung der μLED-Stimulator

1. Für μLEDs zuerst die μLED-Stimulator vorzubereiten. Verwenden blauen LEDs mit 200 von 200 um aktive Oberfläche (μLED, siehe Materialien Tabelle).
2. Solder Drähte an der μLED. Dann kapseln die μLED und die Verbindungen mit Epoxid-Kleber. Lassen Sie das Gerät über Nacht, um die Epoxyhärtung lassen.
3. Für die mechanische Stabilität und die elektrische Isolierung der Drähte Trichter durch einen dünnen Glaskapillare Verwenden von 1 mm Außendurchmesser Borosilikatglas Kapillaren und Abdichtung der Verbindung mit Epoxy (1D), so daß die Kapillare an einem mechanischen Manipulator montiert werden.
   HINWEIS: Thier ist ein Trade-off der Herstellung der Kapsel dick genug, um einen guten elektrischen Isolierung (Vermeidung von Artefakten Stimulation) zu bekommen, aber dünn genug, um die LED frei bewegen innerhalb der Bulla und um es auf den Cochleostomie finden. Es ist eine gute Praxis, mehr als eine LED vorzubereiten.
4. Um eine gute elektrische Isolierung zu bestätigen, zunächst eine Petrischale mit 0,9% NaCl und Dip 3 blanken Kupferdrähten endete in die Flüssigkeit herzustellen. Dies dient dazu, ein Tier mit ABR Elektroden simulieren. Schließen Sie die Drähte an die ABR-Verstärker und von dort auf einem Oszilloskop.
5. Verbinden Sie dann das LED an den Stimulator und tauchen sie in die Lösung, bis es völlig bedeckt ist. Fahren Sie die LED mit Pulse (siehe Schritt 3.1.1) bei der maximal zulässige Strom für mehr als 20 min und kontrollieren Stimulation Artefakte. Wenn sie erscheinen, werfen Sie die LED und versuchen eine neue.

2. Operationsverfahren

1. Verwenden Sie 4-10 Wochen alten transgenen Mäusen, die unter der ChR2 Thy1.2 Promotor (Linie 9in Wang et al. ^13). , Um das Tier zu manipulieren und führen Sie die Operation, verwenden Sie immer sauber und gut identifizierten chirurgische Instrumente.
2. Betäuben Tiere mit einer ip Injektion einer Mischung von Urethan (1,32 mg / kg), Xylazin (5 mg / kg) und Buprenorphin 0,1 ug / g verdünnt in 0,9% steriler Kochsalzlösung und die Maus auf eine Heizplatte für die Aufrechterhaltung der Körper Temperatur bei 37 ° C aufweist. Mit dieser Dosis Anästhesie dauert typischerweise die gesamte Versuchsprotokoll.
   1. Ab 10 Minuten nach der ersten Narkose auf Anzeichen der Erregung durch das Zurückziehen der Pfote Reflex. Im Fall von Bewegungen anzuwenden Erhaltungsdosen von Urethan (0,66 mg / kg) und Buprenorphin (0,05 ug / g) in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt (ohne Xylazin). Wieder überprüfen Sie die Pfotenrückzugsreflex und gehen nur dann, wenn der Reflex fehlt.
3. Die retroaurikulär sorgfältig rasieren in Vorbereitung des Einschnitts. Verwenden Sie ein retroaurikulärennähern, um die Bulla (lufthaltige Paukenhöhle) zu erreichen.
   1. Mit einer Mikropinzette sorgfältig sezieren und / oder zu entfernen Teil der Nackenmuskulatur, zB Platysma, sternocleidomastoideus und Skalenusmuskeln.
   2. Finden und setzen die Bulla (Abbildung 1A). Identifizieren Sie die Bulla als knöcherne Struktur mit einer charakteristischen Kugelform mit einem Ring an der Bulla Oberfläche, die das Einführen des Trommelfells (Abbildung 1A) zeigt. Machen Sie ein Loch mit der Spitze eines Insulin-Nadel direkt unter diesem Ring. Starten Sie dort, entfernen Sie die Knochen, die die Bulla mit einem feinen Rongeur (gnawer) oder Mikropinzetten in einer Weise, dass die promontorium der Cochlea ausgesetzt ist (Abbildung 1B) abdeckt.
4. Für die Cochleostomie, sanft abrasieren die knöcherne Kapsel ein kleines Fenster öffnen (Cochleostomie: ~ 500-800 um), kümmert sich um die häutige Labyrinth (Abbildung 1B) intakt zu lassen. Führen Sie die Cochleostomie auf der zweiten Cochlea-drehen, wie es ist weit genug von der Steigbügelarterie und von der Spitze. Öffnen der Spitze konnte Bruch der Cochlea mit einer Fraktur des modiolus produzieren.
5. Für ein rundes Fenster Einführen einer optischen Faser oder μLED-Implantat Paukentreppe, sorgfältig vergrößern die runde Fensternische durch Kratzen der knöchernen Nische mit der Spitze eines scharfen Skalpell (a Schaufelzahl 11 ist eine gute Option). Verwenden Sie immer eine neue Klinge oder Skalpell. Seien Sie sehr vorsichtig, da die Steigbügel Arterie verläuft ganz in der Nähe des runden Fensters (Abbildung 1B).

3. Optische Stimulation mit zwei Ansätze

1. Für transcochlear Stimulation, Nutzung μLEDs oder einer fasergekoppelten Laser.
   1. Montieren Sie die Kapillare Tragen des μLED auf einem mechanischen Manipulator und sorgfältig positionieren Sie den μLED auf die Cochleostomie. Verwendung oABR von 3-10 ms lang Stimulation von einer Stromquelle (typischerweise 5-40 mA bei 2,7 V) bei 1-5 Hz hervorgerufen, als ein Mittel, um die Position und oder zu optimierenientation der μLED.
   2. Für Laserstimulation, verwenden Sie eine 473 nm Dauerstrichlaser und eine optische Faser 250 um (siehe Materialien). Paar die optische Faser zu einem blauen Laserquelle, die im Idealfall bietet schnelle analoge Steuerung der Leistung (aber mit einer akustisch-optischen Gerät oder eine kurze Verschluss, um den optischen Reiz zu definieren). Mit einem Mikromanipulator, suchen Sie die Spitze der Faser direkt auf die Cochleostomie und fixieren Sie sie mit Zahnzement (transcochlear Stimulation).
2. Für intracochleären Stimulation, legen Sie die Faser durch das runde Fenster in die Scala tympani. Dann nutzen Sie 3-10 ms Laserpulse von 10-30 mW (Macht der Faserausgang) bei 1-5 Hz bis oABR zu entlocken. Die große Amplitude oABR ermöglicht dem Experimentator oABR durch einzelne Impulse auf dem Oszilloskop evozierten zur Optimierung der Position und Ausrichtung des Emitters (μLED oder Faser) mit oABR Amplitude als Auslese beobachten.
3. Nach gut oABR erreicht wurden, fixieren Sie die Faser mit cyanoacrcarboxylat Leim oder Zahnzement und warten, bis der Kleber fest ist.
   HINWEIS: Es ist normal, etwas Flüssigkeit aus der Cochlea herauskommen beobachten. Jedoch zu Problemen bei der Polymerisation des Zements zu vermeiden, empfiehlt es sich, den Bereich mit feinen Dochte austrocknen.

4. Aufnahmen von oABR

1. Legen Nadelelektroden unter der Ohrmuschel, auf dem Scheitel und auf der Rückseite in der Nähe der Beine und schließen diese an den Verstärker.
2. Verstärken den Unterschied Potential zwischen Scheitel und des Warzenfortsatzes Subdermalnadeln. Probe bei einer Rate von 50 kHz und der Filter (1-10.000 Hz). Visualisieren Sie die Potentialdifferenz auf einem Oszilloskop ideal in der Nähe der Aufnahmeeinstellungen für die Optimierung der Position des optischen Stimulator. Verwenden Sie die Signalmittelung (50-1,000x) und die Daten auf einem Computer für die Offline-Analyse.

5. Aufnahmen von optisch evozierte Lokale Feldpotentiale

1. Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Mit einer Pinzette CentRallye ziehen Sie die Haut über den Schädel und führen Sie einen Medianschnitt mit einer Schere, die sich von etwa zwischen den Augen bis zu dem Punkt, wo die Nackenmuskulatur zu befestigen, um den Schädel.
   1. Spiegeln die Haut seitlich. Schneiden Sie die Knochenhaut der Länge nach entlang der Pfeilnaht und entfernen Sie sie seitwärts durch sanftes Reiben der freiliegenden Schädelknochen mit einem Wattestäbchen.
2. Positionieren Sie eine maßgeschneiderte Metallplatte auf den freiliegenden Schädel ca. 1 mm Platz zwischen dem Schwanzende der Platte und Lambda verlassen. Mit einem 0,7 mm Durchmesser bohren sorgfältig bohren ein Loch in den Scheitelbein.
3. Sanft Schraube in einem Schneckendurchmesser von 0,85 mm - als Referenz für Potenziale aus dem Colliculus inferior aufgezeichnet dienen (IC) - Halten Sie die Schraube mit einer Zange so lange wie die Schraube nicht sicher befestigt sind. Stellen Sie sicher, einen guten Kontakt zwischen Schraube und Dura ohne ins Gehirn eindringen. Kleben Sie die Schraube und die Metallplatte auf den Schädel mit Sekundenkleber.
4. Lösen Sie die neck Muskeln vorsichtig aus dem Schädel. Ziehen Sie die Nackenmuskulatur kaudal für circa 1-2 mm. Identifizieren Sie den Schnittpunkt der Sinus sagittalis superior (SSS) und der Quer Sinus (TS). Falls erforderlich, die Transparenz des Schädels durch Befeuchten des Knochens mit physiologischer NaCl-Lösung.
   1. Identifizieren Sie die IC in Mäusen als direkt kaudal der SSS und TS Schnittpunkt liegt. Nach der Identifizierung der Lage der IC langsam und vorsichtig durchführen Trepanation verlauf ca. 0,5 mm bis 1,5 mm rostral nach caudal zum TS und etwa 3 mm seitlich.
   2. Vermeiden Sie Verletzungen des SSS und TS da diese eine erfolgreiche Experiment nicht entgegen. Hier testen, ob das Knochen trepanned hat sich gelöst von sanft eingedrückt wird. Mit einer Pinzette heben langsam vom Knochen.
5. Mit einem entsprechenden Adapter befestigen einer Mehrkanal-Array und heads auf einem Mikromanipulator. Um die Zerstörung der Mehrkanal-Aufnahme-Array beim Einführen in die IC zu verhindern, entfernen Sie vorsichtig die Duramit einem gebogenen Spitze einer kleinen Injektionsnadel ab der Nähe einer Knochenrand.
   1. Entfernen Sie das Tier aus der stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie die Metallplatte in eine Bar, um stereotaktische Fixierung bleiben. Positionieren Sie den Aufnahme-Sonde über die IC und setzen Sie sie unter mikroskopischer Kontrolle, so dass der oberste Kanal ist nur an der Oberfläche sichtbar.
6. Verstärken der Potentialdifferenz zwischen den einzelnen Kanälen des Aufzeichnungsanordnung und der Referenzschraube im Scheitelbein, Probe mit einer Rate von 32 kHz Tiefpassfilter (300 Hz) und Speicher auf einem Computer für die Offline-Analyse.
7. Alle Tiere sollten artgerecht am Ende des Verfahrens vor dem Aufwachraum in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien Euthanasie eingeschläfert werden. Geeignete Methoden der Euthanasie kann Genickbruch oder CO ₂ Inhalation umfassen.

Ergebnisse

Eine optimale Cochleostomie kritisch ist und die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Versuchs. Das heißt, die Fenster regelmäßig ist, klein, und es gibt keine Schädigung der internen Strukturen der Cochlea. Zum Beispiel zeigt Blutungsschaden der Stria vascularis. Ein gutes Beispiel ist in 1B dargestellt.

Mit ChR2-transgenen Mäusen wird ChR2 in den SGNS in der Cochlea (1C) ausgedrückt. Blaues Licht Beleuchtung entweder durch μ...

Diskussion

Die beschriebenen Experimente zeigen die optogenetische Stimulation der SGNS und kann im Prinzip auch für die inneren und / oder äußeren Haarzellen stimulieren, sofern die Expression Opsinen. Diese Experimente erfordern viel Geduld und Sorgfalt. Wie bereits erwähnt, sind die wichtigsten Schritte eine gute Cochleostomie / Rundfenster Einsetzen sowie eine entsprechende Position und Ausrichtung der Lichtquelle.

Es gibt Einschränkungen mit optogenetische Stimulation bei der Verwendung von C...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe