Optogenetic Стимуляция слухового нерва

Резюме

Кохлеарных имплантов (ДИ) позволяют слышать прямым электрической стимуляции слухового нерва. Однако плохое частоты и разрешения, интенсивность ограничивает качество слуха с СНГ. Здесь мы опишем optogenetic стимуляции слухового нерва у мышей в качестве альтернативной стратегии для слухового исследований и разработке будущих ДИ.

Аннотация

Прямая электрическая стимуляция спиральных ганглиев (SGNs) по кохлеарных имплантов (CIS) позволяет открытый понимания речи в большинстве имплантированных глухих субъектов ^{1- 6.} Тем не менее, звук кодирование с текущими СНГ плохое разрешение и частоту интенсивности вследствие широкого распространения тока от каждого электрода контакт активирующего большое количество SGNs вдоль оси tonotopic улитки ^{7- 9.} Оптический стимуляции предлагается в качестве альтернативы электрической стимуляцией, что обещает более ограниченном пространстве активацию SGNs и, следовательно, более высоким разрешением по частоте кодирования. В последние годы, прямой инфракрасной подсветки улитки был использован, чтобы вызвать реакцию в слухового нерва ^10. Тем не менее она требует более высоких энергий, чем электрическая стимуляция ^10,11 и остается неопределенность в отношении базового механизма ^12. Здесь мы опишем метод, основанный на optogenetics стимулировать SGNsс низкой интенсивности синего света, используя трансгенных мышей с нейронной выражения channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ или вируса-опосредованной экспрессии ChR2-вариант поймать ^14. Мы использовали микро-светоизлучающие диоды (μLEDs) и волоконно-связанных лазеров для стимулирования ChR2-выражающие SGNs через небольшой искусственного отверстия (cochleostomy) или круглого окна. Мы анализировали ответов на волосистой части головы записями легких вызванные потенциалы (optogenetic слуховые реагирования ствола мозга: oABR) или микроэлектродов записей от слухового пути и сравнили их с акустической и электрической стимуляции.

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения, 360 миллионов человек во всем мире страдают от потери слуха. В глухих субъектов, прямое электрическая стимуляция SGNs цис обеспечить открытый понимания речи в большинстве из них ^1,2,4,5. Даже при том, ДИ были имплантированы в более чем 200 тысяч людей, поэтому является наиболее успешным neuroprosthesis, звук кодирования обусловлен текущими кохлеарных имплантов ограничено. ДИ на основе электрической стимуляцией с помощью определенного количества электродов, где каждый из них активирует tonotopic область слухового нерва, таким образом, минуя дисфункциональное сенсорную орган Корти в улитке. Нормальный слух слушатели могут дискриминировать более 2000 частот, однако сегодняшние ДИ использовать только до 12-22 частотных каналов ^4. Это связано с широко распространенной тока от каждого стимулирующего электрода ^7,9, активируя большое количество SGNs, которые представляют собой множество различных звуковых частот ^8,15. Этоограничение может быть улучшена с помощью многополярного стимуляцию, но за счет более высокое энергопотребление ^16,17. Их выход динамический диапазон для интенсивности звука также ограничен, как правило, ниже 6-20 дБ ^4,18. По этим причинам, улучшения частоты и разрешения, интенсивность являются важными задачами для повышения производительности CI для улучшения распознавания речи в шумной обстановке, стихосложения понимания и восприятия музыки.

Другой вариант, чтобы стимулировать слуховой нерв является оптический стимуляция. Свет может быть легко направлены в целевой небольшое население SGN, обещает более пространственного ограничения, повышение разрешающей способности по частоте, а также расширение динамического диапазона, в результате чего более высоким разрешением интенсивности. Действительно, кохлеарная стимуляция инфракрасного света показал отличную частотное разрешение на животных моделях ^10,11,19. Одним из недостатков этого вида стимуляции является то, что он требует более высоких энергий, чем электрической стимуляцией 10,11. Кроме того, опасения по поводу способности метода напрямую стимулировать слуховые нейроны были подняты ^12,20.

В качестве альтернативы инфракрасной стимуляции, мы используем optogenetics оказывать SGNs чувствительна к свету. Optogenetics является новым подходом, который сочетает в себе генетические и оптические методы неинвазивного и специально контрольными клетками с высоким временным точностью (отзывы ^{21- 23).} В настоящее время наиболее часто используется модальность использует выражение микробного channelrhodopsin 2 (ChR2) гена Chlamydomonas reinhardtii и их варианты, кодирующую легкую закрытого катионов канал ^24. ChR2 является 7-трансмембранный-спираль белок, который, когда трансдуцированных в нейроны и активируется синим светом, выступает в качестве неселективного канал катион, таким образом, деполяризации клеток ^{24- 27.} ChR2 был хорошо охарактеризован ^{24,28- 31} и многие варианты были разработаны, чтобы изменить ACTIOн спектр, стробирующие свойства и проницаемость ^32,33. Целью нашей работы является установление кохлеарного optogenetics для активации слухового пути. Отметим, что optogenetic подход к стимулируют слуховой нерв требуется генетическую манипуляцию спирального ганглия для выражения channelrhodopsin. Работа с мышами и крысами позволяет использовать доступные трансгенных животных ^13,34,35, которые обеспечивают экспрессию channelrhodopsin с небольшой изменчивостью вдоль оси tonotopic и через ³⁶ животных. Сочетание условных аллелей ³⁷ с соответствующими CRE-строк предусматривает выражения клеточно-специфической. Перенос гена в спирального ганглия других животных требует использования вируса, таких как адено-ассоциированный вирус, который является стандартным подходом в optogenetics ^38, и что мы показали свою эффективность в мышей ^36. Генетические манипуляции и выражение трансгенов, кодирующих чужеродные протеины несут риски для побочных эффектов, таких как IMMUпе ответы и / или распространение, угрозу состояние или даже смерть генетически модифицированных клеток. Для этой демонстрации мы используем трансгенных мышей, экспрессирующих ChR2 в спиральных нейронов ганглиев под Thy-1 промотора ¹³ оптически стимулировать слуховые пути. Отметим, что другие варианты channelrhodopsin могут быть использованы с той же целью, как мы показали, используя вирус-опосредованной передаче варианта поймать ¹⁴ в SGNs ^39.

В то время как кохлеарная optogenetics требуется генетические манипуляции, он предлагает молекулярную настройки для оптимизации стимуляции SGN и обещания улучшить частоту и разрешение интенсивности по сравнению с электрической стимуляции. Optogenetic стимуляция слухового пути очень важен для слуха исследования. Например, он обещает успехи в изучении деятельности зависит от уточнения tonotopy в процессе разработки, в анализе потребности в спектральной интеграции в звуковой localizatионов и от степени взаимодействия частотно-специфических афферентных проекций в центральной слуховой системы.

протокол

Все эксперименты, представленные в этой работе были проведены с этическими стандартами, определенными законодательством Германии для защиты подопытных животных. Университет Геттингена доска для благополучия животных и благополучия животных офис земли Нижняя Саксония утвердил эксперименты.

1 Подготовка μLED-стимулятор

1. Для μLEDs, сначала подготовить μLED-стимулятор. Используйте синие светодиоды с 200 на 200 мкм активной поверхности (μLED см Материалы таблицу).
2. Пайку провода к μLED. Тогда, инкапсуляции μLED и соединения, используя эпоксидный клей. Оставьте на ночь устройства, чтобы эпоксидную лекарство.
3. Для механическая стабильность и электрическая изоляция воронку провода через тонкий стеклянный капилляр, использовать наружным диаметром 1 мм боросиликатного капилляры и запечатать переход с эпоксидной смолой (Рисунок 1D), что капиллярная могут быть установлены на механическом манипуляторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Tвот компромисс изготовления капсулы достаточно толстым, чтобы получить хорошую электрическую изоляцию (избегайте стимуляции артефакты), но достаточно тонким, чтобы светодиод свободно перемещаться внутри буллы и чтобы найти его на cochleostomy. Это хорошая практика, чтобы подготовить более одного светодиода.
4. Чтобы подтвердить хорошую электрическую изоляцию, сначала подготовить чашку Петри с 0,9% NaCl и погружного 3 голыми закончившихся медных проводов в жидкость. Это служит для имитации животное с ABR электродов. Подключите провода к ABR-усилителя, а оттуда на осциллограф.
5. Затем подключите светодиод стимулятора и погрузите его в раствор до тех пор, пока он полностью покрыты. Управлять светодиодом с импульсами (см шаг 3.1.1) при максимальном допустимым током для более 20 мин и проверьте стимуляции артефактов. Если они появляются, отбросить светодиод и попробовать новый.

2 Хирургические процедуры

1. Используйте 4-10 недельного возраста трансгенных мышей, экспрессирующих ChR2 под Thy1.2 промоутер (строка 9В Wang и соавт. ^13). Чтобы манипулировать животное и провести операцию, всегда используйте чистые и хорошо выявленных хирургические инструменты.
2. Обезболить животных с внутрибрюшинной инъекции смеси уретана (1,32 мг / кг), ксилазина (5 мг / кг), и бупренорфин 0,1 мкг / г разводили в 0,9% стерильного раствора NaCl и поместить курсор на нагревательной пластине для поддержания тела Температура, при 37 ° С. С этой дозы, анестезия обычно длится в течение всего экспериментального протокола.
   1. Начиная 10 мин после первоначальной проверки индукции анестезии для признаков возбуждения со стороны лапы отмены рефлекса. В случае движений, применять поддерживающие дозы уретана (0,66 мг / кг) и бупренорфин (0,05 мкг / г), разведенного в 0,9% стерильного раствора NaCl (без ксилазина). Опять проверить лапа снятие рефлекс и исходить только если рефлекс отсутствует.
3. Тщательно брить позадиушной область в подготовке разреза. Используйте позадиушнойподходить для достижения буллу (воздух, содержащих полости среднего уха).
   1. С микро щипцы тщательно анализировать и / или удалить часть мышц шеи, например, подкожная, Грудино и лестничных мышц.
   2. Найти и раскрыть Булла (рисунок 1А). Определить буллу как костной структуры с характерным сферической формы с кольцом на поверхности BULLA, что указывает на вставку барабанной перепонки (фиг.1А). Сделайте отверстие кончиком инсулина иглу чуть ниже этого кольца. Начать там, удалить кости, который охватывает буллу с тонкой кусачки (грызун) или microforceps таким образом, что promontorium улитки подвергается (Фигура 1В).
4. Для cochleostomy, мягко сбрить костную капсулу, чтобы открыть небольшое окно (cochleostomy: ~ 500-800 мкм), заботясь, чтобы оставить нетронутыми Мембранный лабиринт (Рисунок 1В). Выполните cochleostomy на втором кохлеарнойповернуть, поскольку это достаточно далеко от stapedial артерии и от вершины. Открытие вершины может производить разрыв улитки включая перелом Modiolus.
5. Для круглого вставки окна оптического волокна или μLED-имплантата до барабанной лестницы, тщательно увеличить круглого окна нишу, царапая костлявую нишу кончиком острым скальпелем (число лезвие 11 является хорошим вариантом). Всегда используйте новое лезвие или скальпель. Будьте очень осторожны, так как stapedial артерии проходит очень близко к круглым окном (Рисунок 1В).

3 Оптический Стимуляция Использование двух подходов

1. Для transcochlear стимуляции, используйте μLEDs или волокна в сочетании лазера.
   1. Установите капилляр, несущий μLED на механическом манипуляторе и тщательно позиционировать μLED на cochleostomy. Использование oABR, вызванное 3-10 мс длительного стимуляции от источника тока (как правило, 5-40 мА при 2,7 В) на 1-5 Гц, в качестве средства оптимизации положение и илиразориентировки из μLED.
   2. Для лазерной стимуляции, использовать нм лазер 473 непрерывного излучения и оптического волокна (см Материалы) 250 мкм. Пара оптическое волокно с синим лазерным источником, который идеально обеспечивает быстрый аналоговый контроль мощности (иначе использовать акустооптическое устройство или быстрый затвор для определения оптической стимул). Использование микроманипулятора, найдите кончик волокна непосредственно на cochleostomy и исправить его там с помощью стоматологического цемента (transcochlear стимуляции).
2. Для intracochlear стимуляции, вставьте волокно через круглое окно в барабанной лестницы. Затем с помощью 3-10 мсек лазерных импульсов 10-30 мВт (мощности производства волокна) на 1-5 Гц, чтобы выявить oABR. Большая амплитуда oABR позволяет экспериментатору наблюдать oABR вызываемую одиночных стимулов на экране осциллографа для оптимизации положения и ориентации излучателя (μLED или волокна), используя амплитуду oABR как считывания.
3. После того, как хорошо oABR были достигнуты, зафиксировать волокно с cyanoacrylate клей или зубной цемент и ждать, пока клей не затвердеет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это нормально наблюдать некоторое количество жидкости выходит из улитки. Однако, чтобы избежать проблем с полимеризации цемента, желательно, чтобы высушить регион, используя тонкие хлопковые фитили.

4. Записи oABR

1. Вставьте игольчатые электроды под ушной раковины, на вершине и на спине около ног и подключите их к усилителю.
2. Amplify разность потенциала между вершиной и сосцевидного подкожных игл. Образец со скоростью 50 кГц и фильтр (1-10,000 Гц). Визуализация разности потенциала на осциллографе в идеале около установки записи для оптимизации положение оптического стимулятора. Используйте сигнала усреднение (50-1,000x) и хранить данные на компьютере для автономного анализа.

5. Записи оптически Вызванные Часовой потенциалов поля

1. Поместите животное в стереотаксической рамки. Использование щипцов центМитинг потяните кожу, покрывающий череп и выполнить средний разрез с ножницами примерно простирается от между глаз до точки, где мышцы шеи придают черепа.
   1. Отражение кожу с боков. Вырезать надкостницу продольно вдоль стреловидного шва и удалить его вбок, осторожно втирая подвергаются кости черепа с помощью ватного тампона.
2. Расположите на заказ металлическую пластину на открытую черепа, оставляя примерно 1 мм пространство между хвостового конца пластины и лямбда. С диаметром 0,7 мм просверлить просверлить отверстие в теменной кости.
3. Аккуратно закрутите 0,85 мм винтом диаметром - в качестве ссылки для потенциалов, записанных от нижнего холмика (IC) - проведение винт щипцами, пока винт не надежно закреплены. Обеспечить хороший контакт между винтом и твердой мозговой оболочки, не проникая в мозг. Клей винт и металлическую пластину на череп с цианакрилатного клея.
4. Ослабить пЭк мышцы мягко из черепа. Потяните мышцы шеи каудально для ок 1-2 мм. Определить пересечение верхнего сагиттального синуса (SSS) и поперечного синуса (TS). При необходимости, увеличить прозрачность черепа увлажнением кость с физиологическим раствором NaCl.
   1. Определите IC у мышей, как лежал прямо каудальнее SSS и TS пересечения. После идентификации местоположения IC медленно и осторожно выполнить трепанацию, проходящий ок 0,5 мм рострально до 1,5 мм каудально к ТС и примерно 3 мм с боков.
   2. Избегайте травм СНО и TS, поскольку они исключают, что успешный эксперимент. Вот, проверить, был ли трепанации кости становятся рыхлыми по мягко толкая его. Использование щипцов медленно поднимите кость.
5. С соответствующим адаптером прикрепить многоканальный массив и headstage на микроманипулятора. Для предотвращения разрушения массива многоканальной записи во время введения в СК, осторожно удалите твердую мозговую оболочкус загнутым кончиком небольшого иглы для подкожных инъекций, начиная близко к краю кости.
   1. Снимите животное от стереотаксической рамы. Закрепите металлическую пластину на баре оставаться стереотаксической фиксация. Установите записи зонда над IC и вставить его в микроскопическом управления таким образом, что самый верхний канал только видимым на поверхности.
6. Amplify разность потенциала между отдельными каналами массива записи и опорного винта в теменной кости, образец со скоростью 32 кГц, фильтр низких частот (300 Гц) и хранить на компьютере для автономного анализа.
7. Все животные должны быть гуманно умерщвляют по окончании процедуры до анестетика взыскания в соответствии с соответствующими руководящими принципами эвтаназии. Подходящие способы эвтаназии может включать шейки дислокации или CO ₂ ингаляции.

Результаты

Оптимальный cochleostomy имеет решающее значение и повышает вероятность успешного эксперимента. Это означает, что окно является регулярным, небольшой, и нет травмы внутренних кохлеарных структур. Например, кровотечение указывает повреждение сосудистой полоски. Хорошим пример?...

Обсуждение

Описанные эксперименты демонстрируют optogenetic стимуляцию SGNs, и может, в принципе, также могут быть использованы, чтобы стимулировать внутреннюю и / или наружных волосковых клеток, при условии, что выражение опсинов. Эти эксперименты требуют большого терпения и заботы. Как упоминалось ран...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe