A estimulação optogenética do nervo auditivo

Resumo

O implante coclear (IC) permitem ouvir pela estimulação elétrica direta do nervo auditivo. No entanto, a má frequência e intensidade resolução limita a qualidade de ouvir com CIs. Aqui descrevemos estimulação optogenética do nervo auditivo em ratos como uma estratégia alternativa para a investigação auditiva e desenvolvimento de futuros ICs.

Resumo

Estimulação elétrica direta de neurônios do gânglio espiral (SGNs) por implantes cocleares (IC) permite a compreensão da fala aberta na maioria dos surdos implantados ^{1 e 6.} No entanto, o som de codificação com CIs atuais tem baixa freqüência e resolução de intensidade devido a ampla propagação atual de cada contato do eletrodo de ativar um grande número de SGNs ao longo do eixo tonotópico da cóclea ^{7 a 9.} Estimulação óptica é proposto como uma alternativa à estimulação elétrica que promete espacialmente mais confinado a ativação de SGNs e, portanto, a resolução de frequência mais elevada de codificação. Nos últimos anos, a iluminação infravermelha directa da cóclea foi utilizado para evocar respostas do nervo auditivo ^10. No entanto, exige energias mais elevadas do que a estimulação elétrica ^10,11 e incerteza quanto ao mecanismo subjacente ^12. Aqui nós descrevemos um método baseado na optogenética para estimular SGNscom luz azul de baixa intensidade, utilizando camundongos transgênicos com expressão neuronal de channelrodopsina 2 (ChR2) ¹³ ou expressão mediada pelo vírus da captura ChR2 variante ^14. Foram utilizados micro-díodos emissores de luz (μLEDs) e lasers de fibra acoplado para estimular ChR2 expressam SGNs através de uma pequena abertura artificial (cocleostomias) ou da janela redonda. Analisamos as respostas por gravações couro cabeludo dos potenciais evocados de luz (optogenetic auditivo de tronco cerebral de resposta: oABR) ou por gravações microeletrodos da via auditiva e os comparou com estimulação acústica e elétrica.

Introdução

Segundo a Organização Mundial de Saúde, 360 milhões de pessoas no mundo sofrem de perda auditiva. Em indivíduos surdos, estimulação elétrica direta de SGNs por CIs permitir a compreensão da fala aberta na maioria deles ^1,2,4,5. Apesar de CIs foram implantados em mais de 200.000 pessoas, sendo portanto o neuroprosthesis maior sucesso, codificação de som impulsionado pelos atuais implantes cocleares é limitado. IC são baseados na estimulação eléctrica através de um certo número de eléctrodos, em que cada um de uma região activa tonotópico do nervo auditivo, saltando, assim, o órgão de Corti disfuncional sensorial da cóclea. Ouvintes com audição normal podem discriminar mais de 2.000 freqüências, porém CIs de hoje usam somente até 12-22 canais de freqüência ^4. Isto é devido ao fluxo de corrente generalizada de cada eletrodo estimulante ^7,9, a ativação de um grande número de SGNs que representam muitas frequências sonoras diferentes ^8,15. Estelimitação pode ser melhorado utilizando a estimulação multipolar, mas à custa de um maior consumo de energia ^16,17. Sua gama dinâmica de saída para a intensidade do som também é limitado, tipicamente abaixo de 6-20 dB ^4,18. Por estas razões, melhorando frequência ea resolução intensidade são objectivos importantes para aumentar o desempenho do CI para melhorar o reconhecimento de fala em ambientes ruidosos, compreensão prosódia e percepção musical.

Uma opção diferente para estimular o nervo auditivo é a estimulação óptica. A luz pode ser convenientemente focado para atingir uma população pequena SGN, prometendo melhor confinamento espacial, aumentando a resolução de freqüência e também ampliando a gama dinâmica, resultando em uma melhor resolução intensidade. De fato, a estimulação coclear com luz infravermelha mostrou resolução de freqüência excelente em modelos animais ^10,11,19. Uma desvantagem deste tipo de estimulação é que ele requer energias mais elevadas do que a estimulação eléctrica ^{10,11. Além disso, as preocupações sobre a capacidade do método para estimular diretamente os neurônios auditivos têm sido levantadas 12,20.}

Como uma alternativa para a estimulação de infravermelhos, que empregam Optogenetics para tornar SGNs sensível à luz. Optogenética é uma nova abordagem que combina técnicas genéticas e ópticas de forma não invasiva e, especificamente, controlar células com alta precisão temporal (Comentários de ^{21 a 23).} A modalidade actualmente mais frequentemente utilizada emprega a expressão do channelrodopsina 2 (ChR2) gene microbiano de Chlamydomonas reinhardtii, e variantes destes, que codifica um canal de luz fechado catião ^24. ChR2 é uma proteína transmembranar-7-hélice que, quando traduzidas em neurónios e activado pela luz azul, age como canal de catião não-selectivos, assim despolarização das células ^{24 e 27.} ChR2 foi bem caracterizada ^{24,28- 31} e muitas variantes têm sido desenvolvidas para modificar actioespectro n, gating e propriedades de permeabilidade ^32,33. O objetivo do nosso trabalho é estabelecer optogenética coclear para a ativação da via auditiva. Notamos que a abordagem optogenetic para estimular o nervo auditivo requer manipulação genética do gânglio espiral para a expressão de channelrodopsina. Trabalhando com ratos e ratazanas permite a utilização de animais transgénicos, disponíveis ^13,34,35, que proporcionam a expressão de channelrodopsina com pouca variabilidade ao longo do eixo e através tonotópico ³⁶ animais. Combinando alelos condicionais ³⁷ com Cre-linhas apropriadas proporciona a expressão específica de célula. A transferência de genes para o gânglio da espiral de outros animais requer a utilização de vírus, tais como vírus adeno-associado que é um método padrão para Optogenetics ³⁸ e que mostrou funcionar bem em ratos ^36. A manipulação genética e expressão de transgenes que codificam proteínas estranhas riscos de ursos para efeitos adversos, como imunorespostas e / ou proliferação ne, condição comprometida ou até mesmo a morte de células geneticamente manipuladas. Para os fins desta demonstração usamos camundongos transgênicos expressando ChR2 em neurônios do gânglio espiral sob a Thy-1 promotor ¹³ para estimular opticamente da via auditiva. Observamos que outras variantes channelrodopsina podem ser usados ​​para o mesmo propósito que nós demonstramos usando a transferência mediada por vírus da captura variante ¹⁴ em SGNs ^39.

Enquanto optogenética coclear requer a manipulação genética, oferece afinação molecular para a estimulação SGN otimizado e melhorado promessas frequência e resolução de intensidade quando comparada à estimulação elétrica. Estimulação optogenética da via auditiva é altamente relevante para a pesquisa de audição. Por exemplo, ele promete avanços em estudos sobre o refinamento de tonotopia dependente de atividade durante o desenvolvimento, na análise da exigência de integração espectral em localizat somion e da extensão da interação entre projeções aferentes específicas de frequência no sistema auditivo central.

Protocolo

Todos os experimentos apresentados neste trabalho foram realizados com os padrões éticos definidos pela lei alemã de proteção dos animais experimentais. O conselho da Universidade de Goettingen para bem-estar animal e do animal escritório de assistência social do estado da Baixa Saxônia aprovou os experimentos.

1 Preparação de μLED-estimulador

1. Para μLEDs, primeiro prepare o estimulador μLED. Use LEDs azuis com 200 por 200 mM superfície ativa (μLED, ver Tabela Materiais).
2. Fios solda na μLED. Em seguida, encapsular o μLED e as conexões usando cola epóxi. Deixe o dispositivo durante a noite para permitir a cura epóxi.
3. Para a estabilidade mecânica e o isolamento eléctrico dos fios do funil através de um capilar de vidro fino, use 1 mm de diâmetro exterior capilares de borosilicato e vedar a junção com epoxi (Figura 1D), tal que o capilar pode ser montado sobre um manipulador mecânico.
   NOTA: Taqui é um trade-off de fazer a cápsula grossa o suficiente para obter um bom isolamento elétrico (evitando artefatos de estimulação), mas fina o suficiente para permitir que o LED se mover livremente dentro da bolha e para localizá-lo na cocleostomias. É uma boa prática para preparar mais de um LED.
4. Para confirmar bom isolamento elétrico, primeiro preparar uma placa de Petri com 0,9% de NaCl e dip 3 fios de cobre nu encerrados no líquido. Isso serve para simular um animal com eletrodos ABR. Conecte os fios ao ABR-amplificador e de lá para um osciloscópio.
5. Em seguida, conecte o LED para o estimulador e mergulhá-lo na solução até que esteja totalmente coberta. Conduzir o LED com pulsos (consulte a etapa 3.1.1) na corrente máxima permitida por mais de 20 minutos e verifique se há artefatos de estimulação. Se eles aparecem, descarte o LED e tentar uma nova.

2 Procedimento Cirúrgico

1. Use 4-10 semanas de idade, camundongos transgênicos expressando ChR2 sob o promotor THY1.2 (linha 9em Wang et al. ^13). Para manipular o animal e realizar a cirurgia, sempre use ferramentas cirúrgicas limpas e bem identificados.
2. Anestesiar os animais com uma injecção ip de uma mistura de uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg) e buprenorfina a 0,1 mg / g diluídos em solução de NaCl a 0,9% estéril e colocar o rato sobre uma placa de aquecimento para manter o organismo temperatura a 37 ° C. Com esta dose, a anestesia dura em geral de todo o protocolo experimental.
   1. A partir de 10 minutos após a primeira verificação de indução à anestesia de sinais de excitação pelo reflexo de retirada da pata. Em caso de movimentos, aplicação de doses de manutenção de uretano (0,66 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mg / g), diluída em 0,9% de solução de NaCl estéril (sem xilazina). Verifique novamente o reflexo de retirada da pata e prosseguir somente se o reflexo é ausente.
3. Raspar com cuidado a área retroauricular na preparação da incisão. Use um retroauricularaproximar-se para chegar a bula (cavidade do ouvido médio contendo ar).
   1. Com um micro fórceps dissecar cuidadosamente e / ou remover parte dos músculos do pescoço, por exemplo, platisma, esternocleidomastoideo, e scalenes.
   2. Localizar e expor a bula (Figura 1A). Identificar a bula como uma estrutura óssea com uma forma esférica com uma característica do anel sobre a superfície da bula indica que a inserção da membrana timpânica (Figura 1A). Fazer um buraco com a ponta de uma agulha de insulina logo abaixo deste anel. Começar por aí, remover o osso que cobre a bula, com um fino Rongeur (gnawer) ou micropinças de tal maneira que o Promontorium da cóclea é exposto (Figura 1B).
4. Para o cocleostomias, raspar delicadamente fora da cápsula óssea para abrir uma pequena janela (cocleostomias: ~ 500-800 mm), tendo o cuidado de deixar intacto o labirinto membranoso (Figura 1B). Realize o cocleostomias no segundo cocleartransformar, pois é longe o suficiente da artéria estapediana e do ápice. Abrindo as ápice poderia produzir ruptura da cóclea, incluindo uma fratura do modiolus.
5. Para uma janela de inserção rodada de uma fibra óptica ou μLED-implante para timpânica, ampliar cuidadosamente o nicho da janela redonda riscando o nicho ósseo com a ponta de um bisturi afiado (a lâmina número 11 é uma boa opção). Utilize sempre uma nova lâmina ou bisturi. Tenha muito cuidado, pois a artéria estapediana corre muito perto da janela redonda (Figura 1B).

3. Optical Estimulação utilizando duas abordagens

1. Para a estimulação transcoclear, uso μLEDs ou um laser de fibra acoplada.
   1. Monte o capilar levando o μLED em um manipulador mecânico e cuidadosamente posicionar o μLED na cocleostomias. Utilização oABR, provocada por estimulação 3-10 ms de comprimento a partir de uma fonte de corrente (tipicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, como um meio para optimizar a posição e ouientation do μLED.
   2. Para a estimulação de laser, utilizar um laser de onda contínua nm 473 e 250 um uma fibra óptica (ver Materiais). Casal da fibra óptica a uma fonte de laser azul que, idealmente, oferece controle analógico rápido de alimentação (então usar um dispositivo acústico-ótico ou um obturador rápido para definir o estímulo óptico). Usando um micromanipulador, localize a ponta da fibra diretamente na cocleostomias e corrigi-o usando o cimento dental (estimulação transcoclear).
2. Para a estimulação intracoclear, inserir a fibra através da janela redonda na escala timpânica. Em seguida, use 3-10 pulsos de laser ms de 10-30 mW (potência de saída de fibra) em 1-5 Hz para obter oABR. A grande amplitude de oABR permite que o experimentador observar oABR desencadeada por estímulos individuais no osciloscópio para optimizar a posição e orientação do emissor (μLED ou fibra), utilizando amplitude oABR como um limite ler.
3. Uma vez que boa oABR foram alcançados, fixar a fibra com cyanoacrcola ylate ou cimento dental e esperar até que a cola é sólido.
   NOTA: É normal observar um pouco de líquido que sai da cóclea. No entanto, para evitar problemas com a polimerização do cimento, é aconselhável para secar a região utilizando mechas de algodão finas.

4. Gravações de oABR

1. Insira eletrodos de agulha debaixo do pavilhão auricular, no vértice e na parte de trás, perto das pernas e conectá-los ao amplificador.
2. Amplificar a diferença de potencial entre o vértice ea mastóide agulhas subcutâneos. Amostra a uma taxa de 50 kHz e um filtro (1-10.000 Hz). Visualize a diferença de potencial em um osciloscópio de preferência perto da configuração de gravação para otimizar a posição do estimulador óptico. Use média de sinal (50-1,000x) e armazenar os dados em um computador para análise off-line.

5. Gravações de potenciais evocados de campo local opticamente

1. Colocar o animal em um quadro estereotáxico. Utilizando uma pinça centorali puxar a pele que cobre o crânio e realizar uma incisão mediana com uma tesoura que se estende desde aproximadamente entre os olhos para o ponto onde os músculos do pescoço para anexar o crânio.
   1. Refletir a pele lateralmente. Corte o periósteo longitudinalmente ao longo da sutura sagital e removê-lo para um lado, esfregando suavemente o osso craniano exposto com um cotonete.
2. A posição de uma placa de metal feita sob encomenda para a cabeça exposta deixando aproximadamente 1 mm de espaço entre a extremidade caudal da placa e lambda. Com um diâmetro de 0,7 milímetros fure cuidadosamente faça um furo no osso parietal.
3. Gentilmente parafuso em um parafuso de diâmetro 0,85 milímetros - para servir de referência para os potenciais gravados a partir do colículo inferior (CI) - segurando o parafuso com uma pinça, enquanto o parafuso não está bem presa. Garantir um bom contato entre o parafuso e dura, sem penetrar no cérebro. Cole o parafuso e a chapa de metal sobre o crânio com cola de cianoacrilato.
4. Solte o nmúsculos Eck suavemente do crânio. Puxe os músculos do pescoço caudal de cerca de 1-2 mm. Identifique a intersecção do seio sagital superior, (SSS) e do seio transverso (TS). Se necessário, aumentar a transparência do crânio umedecendo o osso com uma solução de NaCl fisiológica.
   1. Identificar o IC em camundongos como mentir diretamente caudal para o cruzamento SSS e TS. Após a identificação da localização da IC lentamente e cuidadosamente realizar uma trepanação ca. estendendo 0,5 milímetros rostralmente a 1,5 mm caudal ao TS e cerca de 3 mm para os lados.
   2. Evite qualquer prejuízo para a SSS e TS como estes impediria uma experiência bem sucedida. Aqui, testar se o osso trepanned tornou-se solto por suavemente empurrando-o. Utilizando uma pinça lentamente levantar o osso.
5. Com um adaptador apropriado fixar um conjunto de canais múltiplos e headstage num micromanipulador. Para evitar a destruição da matriz de gravação multicanal durante a inserção no IC, retire cuidadosamente a duracom uma ponta curvada de uma pequena agulha hipodérmica começando perto de uma extremidade de osso.
   1. Retirar o animal do quadro estereotáxico. Fixar a placa de metal em um bar para permanecer fixação estereotáxico. Posicione a sonda de gravação sobre o IC e inseri-lo sob controle microscópico de modo que o mais alto do canal é apenas visível na superfície.
6. Amplificar a diferença de potencial entre os canais individuais da matriz de gravação e o parafuso de referência no osso parietal, a uma taxa de amostra de 32 kHz, o filtro passa-baixo (300 Hz) e armazenar em um computador para análise off-line.
7. Todos os animais devem ser humanamente eutanasiados ao final do procedimento antes da recuperação anestésica de acordo com as diretrizes da eutanásia relevantes. Os métodos adequados de eutanásia pode incluir o deslocamento cervical ou inalação de CO _2.

Resultados

Um cocleostomias ideal é crítica e aumenta a probabilidade de uma experiência de sucesso. Isto significa que a janela é regular, pequena, e não há prejuízo das estruturas internas da cóclea. Por exemplo, sangramento indica lesão da estria vascular. Um bom exemplo é apresentado na Figura 1B.

Usando ratinhos transgénicos ChR2, ChR2 é expresso nas SGNs dentro da cóclea (Figura 1C). Iluminação azul claro, seja por μLED ou l...

Discussão

As experiências descritas demonstram a estimulação optogenetic dos SGNs, e pode, em princípio, também ser utilizado para estimular as células ciliadas internas e / ou externas, desde que a expressão de opsinas. Esses experimentos exigem muita paciência e carinho. Como mencionado antes, as etapas mais críticas são uma boa cocleostomias / janela redonda de inserção, bem como uma posição adequada e orientação da fonte de luz.

Há limitações com estimulação optogenética ao u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe