Stimolazione optogenetic del nervo uditivo

Riepilogo

Gli impianti cocleari (IC) consentire l'udito attraverso la stimolazione elettrica diretta del nervo uditivo. Tuttavia, la scarsa frequenza e la risoluzione intensità limita la qualità di ascoltare con IC. Qui si descrive la stimolazione optogenetic del nervo uditivo nei topi come una strategia alternativa per la ricerca e lo sviluppo uditivo futuri CI.

Abstract

Stimolazione elettrica diretta di spirale neuroni gangliari (SGNs) per gli impianti cocleari (IC) permette aperto comprensione discorso nella maggior parte dei soggetti sordi impiantati ^{1- 6.} Tuttavia, codifica audio con IC correnti ha scarsa frequenza e intensità risoluzione a causa ampia diffusione corrente da ciascun contatto elettrodo attivando un gran numero di SGNs lungo l'asse tonotopic della coclea ^{7- 9.} Stimolazione ottica viene proposto come alternativa alla stimolazione elettrica che promette spazialmente più limitata attivazione di SGNs e, di conseguenza, la risoluzione maggiore frequenza di codifica. Negli ultimi anni, illuminazione infrarossa diretta della coclea è stato usato per evocare risposte nel nervo uditivo ^10. Tuttavia richiede energie superiori a stimolazione elettrica ^10,11 e l'incertezza rimane per quanto riguarda il meccanismo sottostante ^12. Qui si descrive un metodo basato sulla optogenetics per stimolare SGNsa bassa intensità di luce blu, usando topi transgenici con espressione neuronale di channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ o espressione virus-mediata del pescato ChR2-variante ^14. Abbiamo utilizzato micro-diodi emettitori di luce (μLEDs) e laser in fibra-accoppiato per stimolare SGNs ChR2-esprimono attraverso una piccola apertura artificiale (cocleostomia) o la finestra rotonda. Abbiamo dosato le risposte da registrazioni del cuoio capelluto dei potenziali evocati (light-optogenetic uditivi del tronco encefalico risposta: OABr) o da registrazioni di microelettrodi del percorso uditivo e li abbiamo confrontati con stimolazione acustica ed elettrica.

Introduzione

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, 360 milioni di persone nel mondo soffrono di perdita dell'udito. Nei soggetti non udenti, la stimolazione elettrica diretta del SGNs da CIS abilitare aperto comprensione discorso nella maggior parte di essi ^1,2,4,5. Anche se i CI sono stati impiantati in più di 200.000 persone, quindi essendo il neuroprosthesis di maggior successo, la codifica audio guidato dagli attuali impianti cocleari è limitata. CI sono basati su stimolazione elettrica di un certo numero di elettrodi in cui ognuno attiva una regione tonotopic del nervo uditivo bypassando così l'organo sensoriale disfunzionale del Corti nella coclea. Ascoltatori udito normale possono discriminare più di 2.000 frequenze, tuttavia IC odierni utilizzano solo fino a 12-22 canali di frequenza ^4. Ciò è dovuto alla diffusa flusso di corrente da ciascun elettrodo stimolante ^7,9, attivando un gran numero di SGNs che rappresentano molte diverse frequenze sonore ^8,15. Questolimitazione può essere migliorata mediante stimolazione multipolare ma a scapito di una maggiore potenza assorbita ^16,17. La loro uscita gamma dinamica per intensità del suono è anche limitata, di solito sotto 6-20 dB ^4,18. Per queste ragioni, migliorando la frequenza e la risoluzione intensità sono obiettivi importanti per aumentare le prestazioni CI per migliorare il riconoscimento vocale in ambienti rumorosi, comprensione prosodia e percezione musicale.

Una scelta diversa per stimolare il nervo uditivo è la stimolazione ottica. La luce può essere focalizzata comodamente a bersaglio una piccola popolazione SGN, promettendo una migliore confinamento spaziale, aumentando la risoluzione di frequenza e ampliare anche la gamma dinamica, con conseguente risoluzione intensità migliore. Infatti, la stimolazione cocleare con luce infrarossa ha dimostrato un'eccellente risoluzione in frequenza in modelli animali ^10,11,19. Uno svantaggio di questo tipo di stimolazione è che richiede energie superiori a stimolazione elettrica ^{10,11. Inoltre, le preoccupazioni circa la capacità del metodo di stimolare direttamente i neuroni uditivi sono state sollevate 12,20.}

In alternativa alla stimolazione infrarossi, impieghiamo optogenetics rendere SGNs sensibile alla luce. Optogenetics è un nuovo approccio che combina tecniche genetiche e ottici per non invasivo e controllo specificamente cellule con alta precisione temporale (recensioni ^{21- 23).} La modalità attualmente utilizzata più frequentemente impiega l'espressione del microbica channelrhodopsin 2 (ChR2) gene di Chlamydomonas reinhardtii e sue varianti, che codifica per un canale cationico luce-dipendenti ^24. ChR2 è una proteina transmembrana-7-elica che, quando trasdotto in neuroni e attivato dalla luce blu, agisce come canale cationico non selettivo, depolarizzanti così le cellule ^{di 24 27.} ChR2 è stato ben caratterizzato ^{24,28- 31} e molte varianti sono state sviluppate per modificare action spettro, gating e permeabilità proprietà ^32,33. Lo scopo del nostro lavoro è quello di stabilire optogenetics cocleare per l'attivazione della via uditiva. Notiamo che l'approccio optogenetic per stimolare il nervo uditivo richiede manipolazione genetica del ganglio spirale per l'espressione di channelrhodopsin. Lavorando con topi e ratti consente l'utilizzo di animali transgenici disponibili ^13,34,35, che forniscono espressione di channelrhodopsin con poca variabilità lungo l'asse tonotopic e attraverso gli animali ^36. La combinazione di alleli condizionali ³⁷ con le opportune linee Cre prevede per l'espressione specifica delle cellule. Il trasferimento genico nel ganglio spirale di altri animali richiede l'uso di virus come il virus adeno-associato che è un approccio standard in optogenetics ³⁸ e che abbiamo dimostrato di lavorare bene nei topi ^36. La manipolazione genetica ed espressione di transgeni codificanti per proteine ​​estranee rischi orso di effetti negativi come immurisposte e / o proliferazione ne, condizione compromessa o addirittura la morte delle cellule geneticamente manipolate. Ai fini di questa dimostrazione usiamo topi transgenici che esprimono ChR2 nei neuroni gangliari a spirale sotto il Thy-1 promotore ¹³ per stimolare visivamente il percorso uditivo. Notiamo che altre varianti channelrhodopsin possono essere utilizzati per lo stesso scopo, come abbiamo dimostrato con il trasferimento virus-mediata delle catture variante ¹⁴ in SGNs ^39.

Mentre optogenetics cocleare richiede manipolazione genetica, che offre la sintonizzazione molecolare per la stimolazione SGN ottimizzata e promesse migliorato la frequenza e la risoluzione di intensità rispetto alla stimolazione elettrica. Stimolazione optogenetic della via uditiva è molto rilevante per ascoltare la ricerca. Ad esempio, promette progressi negli studi della raffinatezza attività-dipendente di tonotopy durante lo sviluppo, nell'analisi del requisito di integrazione spettrale localizat suonoione e del grado di interazione tra specifica frequenza proiezioni afferenti al sistema uditivo centrale.

Protocollo

Tutti gli esperimenti presentati in questo lavoro sono stati condotti con gli standard etici definiti dalla legge tedesca per la protezione degli animali da esperimento. L'Università di Goettingen bordo per il benessere degli animali e il benessere degli animali ufficio dello stato della Bassa Sassonia ha approvato gli esperimenti.

1 Preparazione di μLED-stimolatore

1. Per μLEDs, prima preparare il-stimolatore μLED. Utilizzare LED blu con 200 da 200 micron superficie attiva (μLED, vedi Materiali Tavolo).
2. Saldare i fili al μLED. Poi, incapsulare il μLED e le connessioni con colla epossidica. Lasciare il dispositivo durante la notte per consentire la cura epossidica.
3. Per la stabilità meccanica e isolamento elettrico imbuto i fili attraverso un capillare di vetro sottile, usare 1 mm di diametro esterno capillari borosilicato e sigillare la giunzione con resina epossidica (Figura 1D) tale che il capillare può essere montato su un manipolatore meccanico.
   NOTA: Tqui è un trade-off di rendere la capsula di spessore sufficiente per ottenere un buon isolamento elettrico (per evitare artefatti di stimolazione), ma abbastanza sottile per lasciare il LED muoversi liberamente all'interno della bulla e per individuarlo sul cocleostomia. E 'una buona pratica per preparare più di un LED.
4. Per confermare buon isolamento elettrico, prima di preparare un piatto di Petri con il 0,9% di NaCl e dip 3 fili di rame nudo chiusi nel liquido. Questo serve per simulare un animale con elettrodi ABR. Collegare i fili al ABR-amplificatore e da lì a un oscilloscopio.
5. Quindi, collegare il LED allo stimolatore e immergerlo nella soluzione fino a quando non è completamente coperto. Guidare il LED con impulsi (vedere il punto 3.1.1) alla corrente massima consentita per più di 20 minuti e controllare artefatti di stimolazione. Se appaiono, scartare il LED e provare uno nuovo.

2 Procedura chirurgica

1. Utilizzare 4-10 settimana-vecchio topi transgenici che esprimono ChR2 sotto il promotore Thy1.2 (linea 9in Wang et al. ^13). Per manipolare l'animale e di eseguire l'intervento chirurgico, utilizzare sempre strumenti chirurgici puliti e ben identificati.
2. Anestetizzare animali con una iniezione ip di una miscela di uretano (1,32 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), e buprenorfina 0,1 mg / g diluito in soluzione di NaCl allo 0,9% sterile e posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere il corpo temperatura a 37 ° C. Con questa dose, l'anestesia di solito dura per tutto il protocollo sperimentale.
   1. Inizio 10 minuti dopo il check induzione dell'anestesia iniziale per segni di eccitazione da parte del riflesso ritiro zampa. Nel caso di movimenti, applica dosi di uretano (0,66 mg / kg) e buprenorfina (0,05 mcg / g) diluito in soluzione di NaCl allo 0,9% sterile (senza xilazina) manutenzione. Controllare di nuovo il riflesso di ritiro zampa e procedere solo se il riflesso è assente.
3. Radersi con cura la zona retroauricolare in preparazione dell'incisione. Utilizzare un retroauricolareavvicinarsi per raggiungere la bolla (contenente aria cavità dell'orecchio medio).
   1. Con un micro pinza sezionare con cura e / o rimuovere una parte dei muscoli del collo, per esempio, platisma, sternocleidomastoideo e scaleni.
   2. Trovare ed esporre la bulla (Figura 1A). Identificare la bolla come una struttura ossea di forma sferica caratteristico con un anello sulla superficie bolla che indica l'inserimento della membrana timpanica (Figura 1A). Fare un foro con la punta di un ago da insulina sotto questo anello. Avviare lì, rimuovere l'osso che copre la bulla con una multa Rongeur (roditore) o microforceps in modo tale che la promontorium della coclea è esposta (Figura 1B).
4. Per il cocleostomia, delicatamente radersi la capsula ossea per aprire una piccola finestra (cocleostomia: ~ 500-800 micron), avendo cura di lasciare intatto il labirinto membranoso (Figura 1B). Eseguire la cocleostomia sul secondo coclearegirare in quanto è abbastanza lontano dalla arteria stapediale e dall'apice. Aprendo l'apice potrebbe produrre la rottura della coclea tra cui una frattura del modiolus.
5. Per un inserimento finestra rotonda di una fibra ottica o μLED-impianto a scala timpani, allargare con cautela la finestra nicchia rotonda graffiando la nicchia ossea con la punta di un bisturi affilato (un numero lama 11 è una buona opzione). Usare sempre una nuova lama o bisturi. Fate molta attenzione in quanto l'arteria stapediale corre molto vicino alla finestra rotonda (Figura 1B).

3. Stimolazione ottico Uso Due approcci

1. Per la stimolazione transcochlear, uso μLEDs o un laser in fibra accoppiata.
   1. Montare il capillare che porta la μLED su un manipolatore meccanico e con attenzione posizionare il μLED sul cocleostomia. Uso OABr, suscitata da 3-10 stimolazione msec lungo da un generatore di corrente (tipicamente 5-40 mA a 2,7 V) a 1-5 Hz, come mezzo per ottimizzare la posizione e oientation del μLED.
   2. Per la stimolazione laser, utilizzare un nm laser a onda continua 473 e una fibra ottica di 250 micron (vedi Materiali). Coppia la fibra ottica di una sorgente laser blu che offre idealmente controllo analogico veloce di potenza (altrimenti utilizzare un dispositivo acusto-ottico o un otturatore veloce per definire lo stimolo ottico). Utilizzando un micromanipolatore, individuare la punta della fibra direttamente sul cocleostomia e fissarla lì con cemento dentale (stimolazione transcochlear).
2. Per la stimolazione intracochlear, inserire la fibra attraverso la finestra rotonda nella scala timpanica. Quindi utilizzare 3-10 impulsi laser msec di 10-30 mW (potenza di uscita fibra) a 1-5 Hz a suscitare OABr. La grande ampiezza di OABr consente sperimentatore di osservare OABr evocata da stimoli singoli sull'oscilloscopio per ottimizzare la posizione e l'orientamento dell'emettitore (μLED o fibra) utilizzando OABr ampiezza come-out lettura.
3. Una volta buona OABr sono stati raggiunti, fissare la fibra con cyanoacrylate colla o cemento dentale e attendere fino a quando la colla è solido.
   NOTA: È normale osservare un liquido che esce dalla coclea. Tuttavia per evitare problemi con la polimerizzazione del cemento, si consiglia di asciugare la regione utilizzando stoppini di cotone.

4. registrazioni di OABr

1. Inserire agoelettrodi sotto il padiglione auricolare, sul vertice e sul retro vicino alle gambe e collegarli all'amplificatore.
2. Amplifica la differenza di potenziale tra il vertice e mastoide aghi sottocutanei. Campione ad una velocità di 50 kHz e filtro (1-10,000 Hz). Visualizzare la differenza di potenziale su un oscilloscopio idealmente vicino alla configurazione di registrazione per ottimizzare la posizione dello stimolatore ottico. Utilizzare media del segnale (50-1,000x) e memorizzare i dati su un computer per l'analisi offline.

5. Registrazioni di potenziali otticamente Evocati locale campo

1. Posizionare l'animale in una cornice stereotassica. Utilizzando pinze centraduno tirare la cute sovrastante il cranio ed eseguire una incisione mediana con le forbici che si estende da circa mezzo agli occhi al punto in cui i muscoli del collo si attaccano al cranio.
   1. Riflettere la pelle lateralmente. Tagliare il periostio longitudinalmente lungo la sutura sagittale e rimuoverlo lateralmente strofinando delicatamente l'osso cranico esposta con un batuffolo di cotone.
2. Posizionare una piastra metallica su ordine sul cranio esposto lasciando circa 1 mm di spazio tra l'estremità caudale della piastra e lambda. Con un diametro di 0,7 millimetri praticare attentamente praticare un foro nell'osso parietale.
3. Avvitare delicatamente in una vite di diametro 0,85 millimetri - per servire come riferimento per potenziali registrate dal collicolo inferiore (IC) - tenendo la vite con una pinza fino a quando la vite non è fissata saldamente. Garantire un buon contatto tra vite e dura senza penetrare nel cervello. Incollare la vite e la piastra metallica sul cranio con colla cianoacrilato.
4. Allentare il nmuscoli Eck delicatamente dal cranio. Tirare i muscoli del collo caudale per circa 1-2 mm. Identificare l'intersezione del seno longitudinale superiore (SSS) e il seno trasverso (TS). Se necessario, aumentare la trasparenza del cranio inumidendo l'osso con soluzione fisiologica NaCl.
   1. Identificare l'IC nei topi come mentire direttamente caudale fino all'intersezione SSS e TS. Dopo l'identificazione della posizione del IC lentamente e con attenzione eseguire un ca. trapanazione estende 0,5 millimetri rostralmente a 1,5 mm caudalmente al TS e circa 3 mm in direzione laterale.
   2. Evitare qualsiasi pregiudizio per la SSS e TS in quanto questi precluderebbe un esperimento riuscito. Qui, verificare se l'osso trapanato si è sciolto da dolcemente spingendolo. Uso pinze lentamente sollevare l'osso.
5. Con un adattatore adeguato allegare una matrice multicanale e headstage su un micromanipolatore. Per evitare di distruggere la matrice di registrazione multicanale durante l'inserimento nel IC, rimuovere con attenzione la duracon una punta piegata di un piccolo ago ipodermico iniziando vicino ad un bordo osso.
   1. Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico. Fissare la piastra di metallo su una barra di rimanere fissazione stereotassica. Posizionare la sonda di registrazione sul IC e inserirla sotto controllo microscopico tale che la maggior canale superiore è appena visibile in superficie.
6. Amplificare la differenza di potenziale tra i singoli canali della matrice registrazione e la vite di riferimento nell'osso parietale, campione ad una velocità di 32 kHz, filtro passa-basso (300 Hz) e memorizzare in un computer per l'analisi offline.
7. Tutti gli animali devono essere umanamente eutanasia al termine della procedura prima del recupero anestetico in conformità alle linee guida pertinenti eutanasia. Metodi adatti di eutanasia possono includere dislocazione cervicale o CO ₂ inalazione.

Risultati

Un cocleostomia ottimale è critico e aumenta la probabilità di un esperimento riuscito. Ciò significa che la finestra è regolare, piccolo, e non vi è alcun pregiudizio delle strutture cocleari interne. Ad esempio, sanguinamento indica un danno del vascularis stria. Un buon esempio è presentato nella Figura 1B.

Utilizzando topi ChR2-transgenici, ChR2 si esprime nei SGNs all'interno della coclea (Figura 1C). Blu illuminazione a...

Discussione

Gli esperimenti descritti dimostrano la stimolazione optogenetic delle SGNs, e possono, in linea di principio, essere utilizzati anche per stimolare le cellule ciliate interne e / o esterne, a condizione che l'espressione di opsine. Questi esperimenti richiedono molta pazienza e cura. Come detto prima, i passaggi più critici sono una buona / inserimento cocleostomia finestra rotonda e una posizione appropriata e l'orientamento della sorgente luminosa.

Ci sono limitazioni con stimola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe