Stimulation optogenetic du nerf auditif

Résumé

Les implants cochléaires (IC) de permettre l'audition par la stimulation électrique directe du nerf auditif. Cependant, la mauvaise fréquence et la résolution d'intensité limite la qualité de l'audience avec les IC. Nous décrivons ici la stimulation optogenetic du nerf auditif chez la souris comme une stratégie alternative pour la recherche et le développement auditif futurs IC.

Résumé

Stimulation électrique directe des neurones du ganglion spiral (de Sgns) par les implants cochléaires (IC) permet ouvert compréhension de la parole dans la majorité des sujets sourds implantés ^1-6. Néanmoins, le codage du son avec IC actuelles a une mauvaise fréquence et la résolution d'intensité due à large propagation actuelle de chaque contact de l'électrode activation d'un grand nombre de Sgns long de l'axe de la cochlée tonotopique ^{7 9.} Stimulation optique est proposé comme une alternative à la stimulation électrique spatialement plus que les promesses activation de Sgns limite et, par conséquent, une meilleure résolution en fréquence du codage. Au cours des dernières années, l'illumination infrarouge directe de la cochlée a été utilisée pour provoquer des réponses dans le nerf auditif ^10. Néanmoins, il nécessite des énergies supérieures à la stimulation électrique ^10,11 et l'incertitude demeure sur le mécanisme sous-jacent ^12. Ici, nous décrivons une méthode basée sur optogénétique pour stimuler Sgnsavec la lumière bleue de faible intensité, utilisant des souris transgéniques avec expression neuronale de channelrhodopsin 2 (ChR2) ¹³ ou expression du virus médiation de la ChR2 variante Catch ^14. Nous avons utilisé des diodes électroluminescentes (μLEDs) et des lasers à fibre couplé à stimuler Sgns CHR2-exprimant à travers une petite ouverture artificielle (cochléostomie) ou de la fenêtre ronde micro-lumière. Nous avons mesuré les réponses par des enregistrements du cuir chevelu de potentiels évoqués lumière (optogenetic réponse du tronc cérébral: oABR) ou par des enregistrements de microélectrodes de la voie auditive et les avons comparés avec une stimulation acoustique et électrique.

Introduction

Selon l'Organisation mondiale de la santé, 360 millions de personnes dans le monde souffrent de déficience auditive. Chez les sujets sourds, la stimulation électrique directe de Sgns par IC permettre ouvert compréhension de la parole dans la majorité d'entre eux ^1,2,4,5. Même si les IC ont été implantés dans plus de 200.000 personnes, étant ainsi le neuroprosthesis plus de succès, le codage de son entraînée par les implants cochléaires actuels est limitée. IC sont basés sur la stimulation électrique par un certain nombre d'électrodes, où chacune une région active un tonotopique du nerf auditif contournant ainsi l'organe de Corti dysfonctionnement sensoriel dans la cochlée. Auditeurs normo-entendants peuvent distinguer plus de 2000 fréquences, mais les IC d'aujourd'hui utilisent seulement jusqu'à 12-22 canaux de fréquence ^4. Cela est dû à la circulation du courant de chaque électrode généralisée stimulant ^7,9, l'activation d'un grand nombre de Sgns qui représentent ^8,15 nombreuses fréquences sonores différentes. Celimitation peut être améliorée en utilisant une stimulation multipolaire mais au détriment de la consommation d'énergie supérieure ^16,17. Leur dynamique de sortie de l'intensité sonore est également limitée, généralement inférieure à 6-20 dB ^4,18. Pour ces raisons, l'amélioration de la fréquence et la résolution d'intensité sont des objectifs importants pour augmenter les performances du CI pour améliorer la reconnaissance vocale dans des environnements bruyants, la compréhension et la prosodie perception de la musique.

Une option différente pour stimuler le nerf auditif est la stimulation optique. La lumière peut être facilement porté à cibler une petite population de SGN, promettant un meilleur confinement spatial, augmentant la résolution de fréquence et également d'élargir la plage dynamique, résultant en une meilleure résolution d'intensité. En effet, la stimulation cochléaire avec de la lumière infrarouge a montré une excellente résolution de fréquence dans des modèles animaux ^10,11,19. Un inconvénient de ce type de stimulation est qu'il nécessite des énergies plus élevées que la stimulation électrique ^{10,11. En outre, les préoccupations quant à la capacité de la méthode à stimuler directement les neurones auditifs ont été soulevées 12,20.}

Comme une alternative à la stimulation infrarouge, nous employons optogénétique rendre Sgns sensible à la lumière. Optogenetics est une nouvelle approche qui combine les techniques génétiques et optiques non-invasive et de contrôler spécifiquement les cellules avec une grande précision temporelle (Avis ^{21 au 23).} La modalité actuellement la plus fréquemment utilisée emploie l'expression microbienne de la 2 channelrhodopsin (CHR2) gène de Chlamydomonas reinhardtii et des variantes de ceux-ci, codant pour un canal de cation déclenché par la lumière ^24. CHR2 est une protéine à 7 domaines transmembranaires en hélice qui, lorsque transduit dans des neurones et activée par la lumière bleue, agit en tant que canal cationique non sélectif, dépolarisant ainsi les cellules ^{24 27.} ChR2 a été bien caractérisé ^{24,28- 31} et de nombreuses variantes ont été développées pour modifier l'action spectre, déclenchement et de perméabilité ^32,33. Le but de notre travail est d'établir optogénétique cochléaire pour l'activation de la voie auditive. Nous notons que l'approche optogenetic pour stimuler le nerf auditif nécessite une manipulation génétique du ganglion spiral pour l'expression de channelrhodopsin. Utilisation de la souris et le rat permet l'utilisation d'animaux transgéniques ^13,34,35 disponibles, qui fournissent l'expression d'channelrhodopsin avec peu de variabilité le long de l'axe et à travers tonotopique ³⁶ animaux. La combinaison des allèles conditionnels ³⁷ avec Cre-lignes appropriées permet l'expression spécifique des cellules. Le transfert de gènes dans le ganglion spiral d'autres animaux nécessite l'utilisation de virus tels que le virus adéno-associé qui est une approche standard dans optogénétique ³⁸ et que nous avons montré de bons résultats chez la souris ^36. La manipulation génétique et l'expression de transgènes codant pour des protéines étrangères risques baissiers pour les effets indésirables tels que la vacnir des réponses et / ou la prolifération, la situation compromise, voire la mort de cellules génétiquement manipulées. Pour les besoins de la démonstration, nous utilisons des souris transgéniques exprimant CHR2 dans les neurones du ganglion spiral dans le cadre du promoteur Thy-1 de ¹³ à stimuler optiquement la voie auditive. Nous notons que d'autres variantes de channelrhodopsin peuvent être utilisés pour le même but que nous avons démontré en utilisant le transfert de virus médiation de la variante Catch ¹⁴ en Sgns ^39.

Alors que l'optogénétique cochléaire nécessite une manipulation génétique, il offre tuning moléculaire pour optimiser la stimulation SGN et promesses améliorée fréquence et la résolution d'intensité par rapport à une stimulation électrique. Stimulation optogenetic de la voie auditive est très pertinente pour la recherche d'audition. Par exemple, il promet des avancées dans les études sur le raffinement dépendant de l'activité de tonotopie pendant le développement, dans l'analyse de l'exigence d'intégration spectrale dans son localization et de l'étendue de l'interaction entre les projections afférentes fréquence spécifique dans le système auditif central.

Protocole

Toutes les expériences présentées dans cet ouvrage ont été menées avec les normes éthiques définies par la loi allemande sur la protection des animaux de laboratoire. L'Université de Goettingen conseil pour le bien-être des animaux et le bureau de la protection des animaux de l'état de Basse-Saxe ont approuvé les expériences.

1 Préparation de μLED-stimulateur

1. Pour μLEDs, d'abord préparer le stimulateur μLED. Utilisez LED bleues avec 200 par 200 um surface active (μLED, voir le tableau des matériaux).
2. Souder les fils à la μLED. Ensuite, encapsuler le μLED et les connexions à l'aide de la colle époxy. Laissez la nuit de l'appareil pour permettre la guérison époxy.
3. Pour une stabilité mécanique et une isolation électrique des fils d'entonnoir au moyen d'un capillaire en verre mince, en utilisant de 1 mm de diamètre extérieur des capillaires en borosilicate et sceller la jonction avec de l'époxy (figure 1D), de sorte que le tube capillaire peut être monté sur un manipulateur mécanique.
   REMARQUE: Tici est un compromis de faire de la capsule assez épaisse pour obtenir une bonne isolation électrique (en évitant les artefacts de stimulation), mais assez mince pour laisser la LED se déplacer librement à l'intérieur de la bulle et pour la placer sur la cochléostomie. C'est une bonne pratique pour préparer plus d'une LED.
4. Pour confirmer une bonne isolation électrique, d'abord préparer une boîte de Pétri avec 0,9% de NaCl et dip 3 fils de cuivre nus terminés dans le liquide. Cela sert à simuler un animal avec des électrodes ABR. Connecter les fils de l'ABR-amplificateur et de là à un oscilloscope.
5. Ensuite, la LED sur le stimulateur et le plonger dans la solution jusqu'à ce qu'il soit totalement couverte. Conduisez la LED avec des impulsions (voir l'étape 3.1.1) au permis maximale du courant de plus de 20 minutes et vérifier les artefacts de stimulation. Si elles apparaissent, jeter le LED et essayer une nouvelle.

2. procédure chirurgicale

1. Utilisez 4-10 souris transgéniques exprimant une semaine vieux ChR2 sous le promoteur de Thy1.2 (ligne 9dans Wang et al. ^13). Pour manipuler l'animal et effectuer la chirurgie, toujours utiliser des outils chirurgicaux propres et bien identifiés.
2. Anesthésier les animaux par une injection ip d'un mélange d'uréthane (1,32 mg / kg), de xylazine (5 mg / kg), et la buprénorphine 0,1 mg / g dilué dans 0,9% de solution stérile de NaCl et placer la souris sur une plaque chauffante pour maintenir le corps température à 37 ° C. Avec cette dose, l'anesthésie dure généralement pour l'ensemble du protocole expérimental.
   1. Dès le 10 min après l'anesthésie chèque initial d'induction des signes d'excitation par le réflexe de retrait de la patte. En cas de mouvements, appliquer des doses d'entretien de l'uréthane (0,66 mg / kg) et de la buprénorphine (0,05 mg / g) dilué dans 0,9% de solution de NaCl stérile (sans xylazine). Encore une fois vérifier le réflexe de retrait de la patte et procédez seulement si le réflexe est absent.
3. Raser soigneusement la zone rétro-auriculaire en préparation de l'incision. Utilisez un rétro-auriculaireapprocher d'atteindre la bulle (cavité de l'oreille moyenne contenant de l'air).
   1. Avec une pince micro disséquer avec soin et / ou de supprimer une partie des muscles du cou, par exemple, platysma, sterno, et scalènes.
   2. Trouvez et exposer la bulle (figure 1A). Identifier la bulle comme une structure osseuse avec une forme sphérique caractéristique d'un anneau sur la surface de la bulle indique que l'insertion de la membrane tympanique (Figure 1A). Faire un trou avec la pointe d'une aiguille d'insuline juste en dessous de cet anneau. Commencez par là, retirer l'os qui couvre la bulle d'une amende Rongeur (rongeur) ou microforceps de manière à ce que le promontorium de la cochlée est exposée (figure 1B).
4. Pour la cochléostomie, raser doucement la capsule osseuse pour ouvrir une petite fenêtre (cochléostomie: ~ 500-800 um), en prenant soin de laisser intact le labyrinthe membraneux (figure 1B). Effectuer le cochléostomie sur la deuxième cochléairetourner car il est assez loin de l'artère stapédienne et de l'apex. Ouverture des apex pourrait produire une rupture de la cochlée, y compris une fracture de la columelle.
5. Pour une fenêtre ronde insertion d'une fibre optique ou μLED-implant à la rampe tympanique, agrandir attentivement la fenêtre ronde en grattant la niche osseuse avec la pointe d'un scalpel (un certain nombre de lame 11 est une bonne option). Toujours utiliser une nouvelle lame ou d'un scalpel. Soyez très prudent que l'artère stapédienne passe très près de la fenêtre ronde (figure 1B).

3. optique de stimulation en utilisant deux approches

1. Pour la stimulation transcochléaire, utilisation μLEDs ou une fibre laser couplé.
   1. Montez le capillaire portant la μLED sur un manipulateur mécanique et soigneusement positionner le μLED sur le cochléostomie. Utilisation oABR, provoquée par la stimulation de longue 10.3 msec à partir d'une source de courant (typiquement 5-40 mA à 2,7 V) à 5.1 Hz, comme un moyen d'optimiser la position et ouientation du μLED.
   2. Pour la stimulation laser, utilisez un nm laser continu 473 et une fibre optique de 250 um (voir Matériaux). Couple la fibre optique à une source de laser bleu qui offre idéalement commande analogique rapide de puissance (sinon utiliser un dispositif acousto-optique ou une obturation rapide pour définir le stimulus optique). L'aide d'un micromanipulateur, recherchez la pointe de la fibre directement sur le cochléostomie et y fixer avec du ciment (stimulation transcochléaire) dentaire.
2. Pour la stimulation intracochléaire, insérer la fibre à travers la fenêtre ronde dans la rampe tympanique. Ensuite, utilisez 3-10 impulsions laser ms de 10-30 mW (puissance de sortie de la fibre) à 1-5 Hz à obtenir oABR. La grande amplitude de oABR permet à l'expérimentateur d'observer oABR provoquée par des stimuli individuels sur l'oscilloscope afin d'optimiser la position et l'orientation de l'émetteur (μLED ou fibre) en utilisant oABR amplitude comme une sortie lu.
3. Une fois bien oABR ont été atteints, fixer la fibre avec cyanoacrcolle ylate ou ciment dentaire et d'attendre jusqu'à ce que la colle est solide.
   NOTE: Il est normal d'observer un peu de liquide sortant de la cochlée. Cependant, pour éviter les problèmes avec la polymérisation du ciment, il est conseillé de sécher la région à l'aide de fines mèches de coton.

4. enregistrements de oABR

1. Insérez électrodes aiguilles sous le pavillon de l'oreille, sur le sommet et sur le dos près des jambes et de les connecter à l'amplificateur.
2. Amplifier le potentiel de différence entre le sommet et la mastoïde aiguilles hypodermiques. Échantillon à une vitesse de 50 kHz et de filtrage (1-10,000 Hz). Visualiser la différence de potentiel sur un oscilloscope idéalement à proximité de l'installation d'enregistrement pour optimiser la position de l'appareil de stimulation optique. Utilisez étalement du signal (50-1,000x) et de stocker les données sur un ordinateur pour une analyse hors ligne.

5. enregistrements de potentiels évoqués optiquement terrain local

1. Placez l'animal dans un cadre stéréotaxique. En utilisant des pinces centrallye tirer la peau recouvrant le crâne et effectuer une incision médiane avec des ciseaux qui s'étend approximativement d'entre les yeux au point où les muscles du cou se fixent sur le crâne.
   1. Refléter la peau latéralement. Couper le périoste de la longueur le long de la suture sagittale et retirer latéralement en frottant doucement l'os crânien exposée avec un coton-tige.
2. Positionner une plaque de métal sur mesure sur le crâne exposé en laissant un espace d'environ 1 mm entre l'extrémité caudale de la plaque et lambda. Avec un diamètre de 0,7 mm percez soigneusement percer un trou dans l'os pariétal.
3. Vissez doucement dans une vis de 0,85 mm de diamètre - pour servir de référence pour les potentiels enregistrés dans le colliculus inférieur (IC) - en maintenant la vis avec une pince aussi longtemps que la vis n'est pas solidement fixé. Assurer un bon contact entre la vis et dure sans pénétrer dans le cerveau. Coller la vis et la plaque de métal sur le crâne avec de la colle cyanoacrylate.
4. Desserrer le neck muscles en douceur du crâne. Tirez sur les muscles du cou caudale pour environ 1-2 mm. Identifier l'intersection du sinus sagittal supérieur (SSS) et le sinus transverse (TS). Si nécessaire, augmenter la transparence du crâne en humidifiant l'os avec une solution physiologique de NaCl.
   1. Identifier l'IC chez la souris que se trouve directement caudale à l'intersection SSS et TS. Après l'identification de l'emplacement de l'IC lentement et soigneusement effectuer une trépanation environ s'étendant 0,5 mm à 1,5 mm rostralement caudale de la TS et environ 3 mm latéralement.
   2. Éviter toute blessure à la SSS et TS comme ceux-ci empêcherait une expérience réussie. Ici, vérifier si l'os trépané s'est desserrée par doucement pousser. Aide d'une pince soulever lentement l'os.
5. Avec un adaptateur approprié joindre un réseau multicanal et headstage sur un micromanipulateur. Pour éviter la destruction de l'ensemble de l'enregistrement multicanal lors de l'insertion dans l'IC, retirez soigneusement la dureavec une extrémité recourbée d'une petite aiguille hypodermique commençant à proximité d'un bord de l'os.
   1. Retirer l'animal du cadre stéréotaxique. Fixer la plaque de métal sur une barre de rester fixation stéréotaxique. Placez la sonde d'enregistrement sur l'IC et l'insérer sous contrôle microscopique tels que le plus haut canal est à peine visible à la surface.
6. Amplifier le potentiel de différence entre les canaux individuels de la matrice d'enregistrement et de référence de la vis dans l'os pariétal, l'échantillon à une vitesse de 32 kHz, le filtre passe-bas (300 Hz) et à stocker sur un ordinateur pour une analyse hors ligne.
7. Tous les animaux doivent être euthanasiés à la fin de la procédure préalable à la reprise anesthésie conformément aux directives pertinentes de l'euthanasie. Les méthodes d'euthanasie appropriées peuvent comprendre dislocation cervicale ou inhalation de CO _2.

Résultats

Un cochléostomie optimal est essentiel et augmente la probabilité d'une expérience réussie. Cela signifie que la fenêtre est régulière, petite, et il n'y a pas de blessure des structures cochléaires internes. Par exemple, des saignements indique dégâts de la strie vasculaire. Un bon exemple est présenté à la figure 1B.

En utilisant des souris transgéniques CHR2, CHR2 est exprimé dans les Sgns l'intérieur de la cochlée

Discussion

Les expériences décrites démontrent la stimulation des optogenetic Sgns, et peuvent, en principe, également être utilisés pour stimuler les cellules ciliées internes et / ou externes, à condition que l'expression des opsines. Ces expériences nécessitent beaucoup de patience et de soins. Comme mentionné précédemment, les étapes les plus critiques sont une bonne cochléostomie / insertion autour de la fenêtre ainsi que la position et l'orientation appropriée de la source de lumière.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Urethane	Sigma Aldrich	U2500-100G	Anesthetic
Xylazine HCl	RXV		Sedative and analgesic
Buprenorphine	Reckitt Benckiser		Analgesic
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20	Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14060-09	To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs	Fine Science Tools	16004-16	They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser	Changchun New Industries	MLL-III473	100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver	Changchun New Industries	DPSSL MLL 100 mW	TTL operated laser driver
250 µm optical fiber	Any comercial ; e.g. Thorlabs	M42L05
Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	PCAOM VIS	Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter	Gentec-EO		Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED	Cree	C470UT200	It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill	World Precision Instruments	503598	Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19007-07
Self tapping bone screw	any commercial; e.g. Fine Science Tools	19010-10	Reference screw
Micromanipulator	any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis		Positioning of recording probe