JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Abstract

فعالية بروتوكولات استخراج الحمض النووي يمكن أن تعتمد بشكل كبير على كل من نوع العينة التي يجري التحقيق فيها وأنواع من التحليلات المصب تنفيذها. يمكن النظر إلى أن استخدام تقنيات تحليل المجتمع البكتيرية الجديدة (على سبيل المثال، microbiomics، metagenomics) أصبحت أكثر انتشارا في مجال العلوم الزراعية والبيئية والعينات البيئية العديدة ضمن هذه التخصصات تكون physiochemically وفريدة من نوعها الميكروبيولوجية (على سبيل المثال، البراز وعينات القمامة / الفراش من الدواجن الطيف الإنتاج)، بحاجة الى طرق استخراج الحمض النووي المناسبة والفعالة ليتم اختياره بعناية. لذلك، تم تطوير DNA هجين طريقة استخراج رواية شبه الآلي خصيصا للاستخدام مع عينات إنتاج الدواجن البيئي. هذا الأسلوب هو مزيج من اثنين من أنواع رئيسية من استخراج الحمض النووي: الميكانيكية والأنزيمية. ومكثفة خطوة التجانس الميكانيكية من خطوتين (باستخدام حبة الضرب وضعت خصيصا للبالبيءهتمت إضافة عينات التل) إلى بداية "المعيار الذهبي" الأنزيمية طريقة استخراج الحمض النووي لعينات البراز لتعزيز إزالة البكتيريا وDNA من عينة مصفوفة وتحسين الانتعاش من أعضاء غرام إيجابي المجتمع البكتيري. مرة واحدة وقد بدأ الجزء استخراج الأنزيمي من الأسلوب الهجين، تم أتمتة عملية تنقية المتبقية باستخدام محطة عمل الروبوتية لزيادة الإنتاجية وتقليل العينة خطأ معالجة العينة. وبالمقارنة مع طرق استخراج الحمض النووي صارمة الميكانيكية والأنزيمية، وقدم هذه الطريقة الهجينة الرواية على أفضل أداء مجتمعة عموما عند النظر في الكمية (باستخدام 16S الرنا الريباسي QPCR) والنوعي (باستخدام microbiomics) تقديرات من إجمالي المجتمعات البكتيرية عند معالجة البراز الدواجن والعينات القمامة .

Introduction

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)7, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)8, and phylogenetic microarrays9. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic12,13 or microbiomic14 questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency9, DNA yield/quality1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. التجانس الميكانيكي للدواجن البيئي عينات الإنتاج

  1. قبل استخراج، تعيين حمام مائي إلى 95 درجة مئوية، وتسمح في الوقت حمام الماء لتصل إلى أن درجة الحرارة.
  2. تزن من 0.33 غرام من التربة أو المواد البرازية إلى 2 مل الناشر مصفوفة E الأنبوب.
    1. لا تتجاوز 0.33 غرام من العينة في الأنبوب، لأن هذا سوف يتسبب في الحلول التالية لتتجاوز قدرة الأنبوب.
    2. العينات المجمدة ذوبان الجليد لRT قبل وزنها.
    3. من أجل تحليل ما مجموعه 1 غرام من التربة / البراز، وتزن من 3 تكرار 0.33 ز عينات لكل عينة البيئية الفردية.
    4. عينات في مخزن -20 ° C داخل أنابيب مصفوفة المخروطية قبل الاستخراج، وإذا لزم الأمر.
  3. إضافة 825 ميكرولتر فوسفات الصوديوم العازلة و 275 ميكرولتر من PLS حل لأنبوب العينة. مزيج باستخدام الدوامة ل~ 15 ثانية ثم الطرد المركزي العينات في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. صب supernaتانت وإضافة 700 ميكرولتر من العازلة ASL. مزيج باستخدام الدوامة لمدة 5 ثانية.
    1. ضمان وجود فراغ الرأس (~ الحجم الكلي 10٪) متوفرة في أنبوب مخروطي الشكل في هذه المرحلة. إذا لم يكن هناك فراغ الرأس، فإن أنابيب لديهم ميل إلى تسرب خلال الخطوة التجانس المقبلة مما قد يؤدي إلى انتقال التلوث و / أو فقدان العينة.
  5. وضع العينات في FastPrep 24 الصك، والتجانس العينات بسرعة 6.0 م / ثانية لمدة 40 ثانية.
  6. أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف لالعقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge.
  7. لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش DNA من العينة، كرر الخطوات من 1،4-1،6، والجمع بين supernatants في نفس عقيمة، 2 مل أنبوب microcentrifuge.

2. الأنزيمية تثبيط المانعون من عينة الخليط

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول كيت QIAamp DNA البراز البسيطة.

  1. احتضانطاف في 95 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق لتعظيم الانتعاش DNA من أي الخلايا المتبقية داخل طاف.
    1. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة العينات التي تحتوي على الكائنات الحية في معظمها سلبية الغرام. لكن في حالة وجود (كما هو الحال مع عينات البراز الدواجن) الكائنات إيجابية الجرام، في احتضان 95 درجة مئوية.
    2. استخدام البلاستيك قفل قطات على أنابيب microcentrifuge للتأكد من أن أنابيب لن "البوب" فتح ويحتمل أن تفقد حجم العينة كما ضغط يمكن أن تتراكم في هذه أنابيب microcentrifuge مختومة.
  2. فتح كل أنبوب microcentrifuge للافراج عن الضغط، وإعادة للحد الأقصى للأنابيب microcentrifuge ومزيج باستخدام الدوامة لمدة 15 ثانية.
  3. الطرد المركزي العينة في 14،000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة 1.2 مل من طاف ووضعه في العقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge جديد.
  4. إضافة 1 التبويب InhibitEx لكل عينة، ومزيج باستخدام الدوامة حتى تصبح العينة أبيض موحد / السائل من البيض.
    1. تجنب رouching علامة التبويب InhibitEx حين وضعها في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة. ولتحقيق ذلك، وضع حزمة نفطة التي تحتوي على علامة التبويب مباشرة فوق أنبوب microcentrifuge مفتوحة ودفع برفق فوق علامة التبويب للخروج من حزمة نفطة وإلى أنبوب microcentrifuge.
  5. احتضان العينة لمدة 1 دقيقة في RT (~ 25 ° C) وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نقل جميع السائل إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
    1. تجنب أي الجسيمات المتبقية التي قد تكون مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب microcentrifuge في نهاية الخطوة 2.5 عند نقل السائل.

3. الآلي DNA تنقية باستخدام الروبوتية محطة QIAcube

ملاحظة: عدد من المواد الاستهلاكية البلاستيكية، وترتيب محولات عينة الدوار داخل أجهزة الطرد المركزي، والكميات المطلوبة من مخازن / حلول تعتمد على الأسطواناتنوفمبر من العينات التي يتم تشغيل.

  1. إضافة أنابيب شطف وأنابيب مرشح لفتحات مناسبة داخل محولات الدوار. لكل عينة، إضافة 400 ميكرولتر إلى فتحة الوسطى من محول الدوار. وضع محولات الدوار في أجهزة الطرد المركزي محطة عمل في الترتيب الصحيح وفقا لعدد من العينات التي تنقيته.
    1. تأكد من أن جميع الأغطية أنبوب microcentrifuge يتم تأمينها بشكل صحيح داخل محول الدوار منذ الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى قص خلال واحدة من الخطوات الطرد المركزي من بروتوكول تنقية.
  2. إضافة العدد المطلوب من 1،000 ميكرولتر و 200 ميكرولتر تصفية نصائح إلى محطة العمل، وملء الزجاجات عازلة المتوفرة مع حجم المطلوب من المخازن المؤقتة.
    ملاحظة: وترد جميع المخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول تنقية (AL، AW1، AW2، وAE) ضمن مجموعة QIAamp DNA البراز البسيطة. يحتاج المستخدم لتوريد الإيثانول بنسبة 100٪ أن هناك حاجة لبو AWffers وكحل المستخدمة في عملية التنقية.
  3. إضافة الكمية المطلوبة من بروتين K الحل الموردة إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ووضعه في فتحة وعلى محطة العمل. أيضا، إضافة العدد المطلوب (مساو لعدد العينات التي يجري تنقيتها) من 2 مل آمنة للانغلاق أنابيب العينات ميكروسنتريفوج RB إلى قسم شاكر من محطة العمل.
    1. تأكد من أن أغطية الأنابيب عينة يتم وضعها بإحكام في فتحات مناسبة على محطة العمل، لأن عدم القيام بذلك سيؤدي إلى خطأ عندما يكون الجهاز بمسح البداية محطة العمل للتأكد كلها البلاستيك والسوائل اللازمة المتاحة للطلب تشغيل.
  4. استخدام الشاشة التي تعمل باللمس على محطة العمل، حدد البراز DNA - البراز البشري - بروتوكول كشف مسببات الأمراض، وقراءة من خلال شاشات اللاحقة للتأكد من أن محطة العمل تم تحميلها بشكل صحيح. مرة واحدة يتم تمرير جميع الشاشات الاختيار، حدد ابدأ لتشغيل هذا البروتوكول.
    1. إذا استخراج الحمض النووي من أكثر من 12 عينة، تبدأ عملية التجانس (الخطوة 1) للمجموعة التالية من العينات، منذ سلسلة من 12 عينة يأخذ ~ 72 دقيقة لإكمال على محطة العمل.
  5. إزالة عينات من محولات الدوار، وكأب لهم، ومكان في -20 ° C لحين الحاجة إليها لتحليل المصب اللاحقة.
    1. في هذه المرحلة، والجمع بين التنقيات تكرار 3 لعينة الفردية (المجموع تحليل كمية = 1 غرام) باستخدام / نظام قائم على التبخر الطرد المركزي. الجمع بين مكررات وإعادة أزل إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من العازلة تريس، ETDA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لهذه الدراسة، تم انتشال فضلات البراز الطازجة وعينات القمامة من منزل التجاري اللاحم (~ 25،000 الطيور) في جنوب شرق الولايات المتحدة. وكانت الفراريج (جالوس جالوس) كوب-500 الصلبان، وكانوا 59 يوما من العمر في وقت أخذ العينات. تم انتشال عينات برازية والقمامة جديدة من أربع من...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة تنفذ إجمالي تقديرات المجتمع البكتيرية الكمية والنوعية لكل من عينات برازية والقمامة، ودعم تحاليل العينة طبيعة تعتمد أساليب الاستخراج DNA كما كان في السابق 1،3،6. لكل من عينات برازية والقمامة، وكان ترتيب أداء أساليب الاستخراج...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Latoya Wiggins and Katelyn Griffin for their assistance in sample acquisition, as well as Laura Lee Rutherford for their assistance in sampling and molecular analyses. We would also like to thank Sarah Owens from Argonne National Lab for microbiomic sample preparation and sequencing. These investigations were supported equally by the Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 and “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate SolutionMPBio6570-205Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)Qiagen990394For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

References

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

94 microbiomics QPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved