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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Résumé

L'efficacité des protocoles d'extraction d'ADN peut être très dépend à la fois du type d'échantillon objet de l'enquête et les types d'analyses effectuées en aval. Considérant que l'utilisation de nouvelles techniques d'analyse de la communauté bactérienne (par exemple, microbiomique, métagénomique) est de plus en plus répandue dans les sciences agricoles et environnementales et de nombreux échantillons de l'environnement au sein de ces disciplines peut être physiochimique et microbiologiquement uniques (par exemple, les selles et les échantillons litière / literie de le spectre de la production de volaille), les méthodes d'extraction d'ADN appropriées et efficaces doivent être choisis avec soin. Par conséquent, une méthode d'extraction d'ADN hybride roman semi-automatique a été développé spécifiquement pour une utilisation avec des échantillons de production de volaille de l'environnement. Cette méthode est une combinaison des deux types principaux de: extraction d'ADN enzymatique et mécanique. A deux étapes intense étape d'homogénéisation mécanique (en utilisant cordon de battre spécialement formulé pour enviTal échantillons) ont été ajoutés au début du procédé d'extraction d'ADN de «gold standard» enzymatique des échantillons fécaux pour améliorer l'élimination des bactéries et de l'ADN à partir de la matrice de l'échantillon et d'améliorer la récupération d'éléments à Gram positif communauté bactérienne. Une fois que la portion d'extraction enzymatique du procédé hybride a été lancé, le procédé de purification restant a été automatisé en utilisant un poste de travail robotique pour augmenter et diminuer le débit d'échantillons échantillon erreur de traitement. En comparaison avec les méthodes mécaniques et enzymatiques strictes extraction de l'ADN, cette méthode hybride roman fourni la meilleure performance globale combinée lors de l'examen quantitatif (en utilisant l'ARNr 16S qPCR) et qualitative (en utilisant microbiomique) des estimations des communautés bactériennes totales lors du traitement des excréments de volaille et des échantillons de litière .

Introduction

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)7, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)8, and phylogenetic microarrays9. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic12,13 or microbiomic14 questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency9, DNA yield/quality1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

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Protocole

1. homogénéisation mécanique de volailles de l'environnement Échantillons de production

  1. Avant l'extraction, régler un bain d'eau à 95 ° C et laisser le temps du bain d'eau pour atteindre cette température.
  2. Peser 0,33 g de sol ou de matières fécales dans un 2 ml de lyse Matrice E tube.
    1. Ne pas dépasser 0,33 g d'échantillon dans le tube, car dans ce cas les solutions suivantes pour dépasser la capacité du tube.
    2. Dégeler les échantillons congelés à RT avant la pesée.
    3. Afin d'analyser un total de 1 g de sol / matières fécales, peser 3 répliquer 0,33 g échantillons pour chaque échantillon environnementale individuelle.
    4. Conserver les échantillons à -20 ° C dans les tubes de matrice coniques avant l'extraction, si nécessaire.
  3. Ajouter 825 ul de tampon phosphate de sodium et 275 ul de solution PLS à un tube d'échantillon. Mélanger en utilisant un vortex pendant environ 15 secondes, puis centrifuger les échantillons à 14 000 xg pendant 5 min.
  4. Décanter le supernaTant et ajouter 700 ul de tampon ASL. Mélanger en utilisant un vortex pendant 5 secondes.
    1. Assurez-vous que l'espace libre est (~ 10% du volume total) disponibles dans le tube conique à ce point. Se il n'y a pas d'espace de tête, les tubes vont avoir tendance à se échapper au cours de la prochaine étape d'homogénéisation qui pourrait conduire à une contamination croisée et / ou la perte de l'échantillon.
  5. Placer les échantillons dans un 24 instrument FastPrep, et homogénéiser les échantillons à une vitesse de 6,0 m / s pendant 40 s.
  6. Centrifuger l'échantillon homogénéisé à 14 000 g pendant 5 min. Transférer le surnageant dans un 2 ml microtube stérile.
  7. Pour maximiser la récupération de l'ADN de l'échantillon, répéter les étapes 1.4 à 1.6, en combinant les surnageants dans la même stérile, 2 ml tube de microcentrifugation.

2. Inhibition enzymatique des inhibiteurs d'exemples à partir d'homogénats

NOTE: Ce protocole utilise le kit QIAamp DNA Stool Mini.

  1. Incuber lasurnageant dans un bain d'eau à 95 ° pendant 5 minutes pour maximiser la récupération d'ADN à partir des cellules restantes dans le surnageant.
    1. Incuber à 70 ° C pour la plupart des échantillons contenant des organismes à Gram négatif. Toutefois, si des organismes Gram-positifs sont présentes (ce qui est le cas de la volaille échantillons fécaux), incuber à 95 ° C.
    2. Utilisez des pinces de blocage en plastique sur les microtubes de se assurer que les tubes ne seront pas «pop» ouvert et potentiellement perdre volume de l'échantillon que la pression peut se accumuler dans ces microtubes scellés.
  2. Ouvrez chaque microtube pour relâcher la pression, re-capitalisation des microtubes et mélanger à l'aide d'un vortex pendant 15 secondes.
  3. Centrifuger l'échantillon à 14 000 g pendant 1 min, retirer 1,2 ml du surnageant et le placer dans un nouveau 2 ml microtube stérile.
  4. Ajouter une onglet Inhibitex à chaque échantillon et mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à l'échantillon devient un liquide uniformément blanc / blanc cassé.
    1. Évitez touching l'onglet Inhibitex en le plaçant dans le tube à centrifuger contenant l'échantillon. Pour ce faire, placez le blister contenant l'onglet directement sur le tube de microcentrifugeuse ouvert et pousser délicatement la languette sur le blister et dans le tube à centrifuger.
  5. Incuber l'échantillon pendant 1 minute à température ambiante (~ 25 ° C) et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min.
  6. Transférer tout le liquide à un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et centrifuger à 14 000 g pendant 5 min.
    1. Eviter les particules restantes qui peuvent avoir culot au fond du tube de microcentrifugation à la fin de l'étape 2.5 lors du transfert du liquide.

3. automatisé de purification d'ADN Utilisation du poste de travail robotique QIAcube

REMARQUE: Le nombre de consommables en plastique, la disposition des adaptateurs échantillon de rotor dans la centrifugeuse, et les volumes requis des tampons / solutions dépendent de la numbre d'échantillons qui sont en cours d'exécution.

  1. Ajouter tubes d'élution et les tubes de filtre pour les emplacements appropriés dans les adaptateurs de rotor. Pour chaque échantillon, ajouter 400 ul de milieu de la fente de l'adaptateur de rotor. Placer les adaptateurs de rotor dans la centrifugeuse du poste de travail dans le bon arrangement en fonction du nombre d'échantillons en cours de purification.
    1. Assurez-vous que tous les couvercles de tubes à centrifuger sont correctement fixés dans l'adaptateur de rotor depuis un défaut de le faire pourrait entraîner en cisaillement lors d'une des étapes de centrifugation du protocole de purification.
  2. Ajouter le nombre requis de 1 000 pi et 200 pi-filtres conseils pour le poste de travail, et de remplir les bouteilles tampons fournis avec le volume requis de tampons.
    REMARQUE: Les tampons nécessaires pour ce protocole de purification (AL, AW1, AW2, et AE) sont tous contenus dans le kit QIAamp DNA Stool Mini. L'utilisateur doit fournir de l'éthanol à 100% ce qui est nécessaire pour la BU AWffres et comme une solution utilisée dans le procédé de purification.
  3. Ajouter le volume nécessaire de la solution fournie de protéinase K dans un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et le placer dans la fente A sur le poste de travail. En outre, ajouter le nombre requis (égal au nombre d'échantillons purifiés) de 2 ml coffre-blocage des tubes à échantillon à centrifuger RB à la section d'agitateur de la station de travail.
    1. Veiller à ce que les couvercles des tubes échantillons sont bien placés dans les emplacements appropriés sur le poste de travail, car un échec de le faire se traduira par une erreur lorsque l'appareil numérise d'abord le poste de travail pour se assurer que tous les plastiques et liquides nécessaires sont disponibles pour la demande fonctionner.
  4. Utiliser l'écran tactile sur le poste de travail, sélectionnez l'ADN Tabouret - Tabouret humain - Protocole de détection de pathogènes, et de lire à travers les écrans qui suivent pour se assurer que le poste de travail a été chargé correctement. Une fois tous les écrans de contrôle sont passés, sélectionnez Démarrer pour exécuter ce protocole.
    1. Si extraire l'ADN de plus de 12 échantillons, commencer le processus d'homogénéisation (étape 1) pour la prochaine série d'échantillons, depuis une série de 12 échantillons prend ~ 72 min pour terminer sur le poste de travail.
  5. Retirez les échantillons des adaptateurs de rotor, plafonner eux, et le lieu de -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour les analyses ultérieures en aval.
    1. À ce stade, combiner les trois purifications répétées pour un échantillon individuel (total analysé quantité = 1 g) en utilisant un système de centrifugation / base évaporation. Combiner les répétitions et ré-élution à un volume final de 100 ul de tampon Tris-EDTA.

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Résultats

Pour cette étude, les fientes fraîches et échantillons de litière ont été récupérés à partir d'une maison de commerce de poulets de chair (~ 25 000 oiseaux) dans le sud-est des États-Unis. Les poulets de chair (Gallus gallus) étaient Cobb-500 traverse, et ils étaient âgés de 59 jours au moment de l'échantillonnage. Échantillons de matières fécales et des litières fraîches ont été récupérés à partir de quatre domaines distincts dans la maison (près de garniture de refroidissem...

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Discussion

La méthode d'extraction d'ADN utilisée effectué les estimations totales communautaires bactériennes quantitatifs et qualitatifs pour les deux échantillons de matières fécales et de la litière, supportant l'échantillon analyses nature dépendante des méthodes d'extraction d'ADN vu précédemment 1,3,6. Pour les deux échantillons de matières fécales et de la litière, l'ordre d'exécution des méthodes d'extraction d'ADN était différent pour le quantitatif (mé...

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Déclarations de divulgation

The authors have nothing to disclose.

Remerciements

The authors would like to acknowledge Latoya Wiggins and Katelyn Griffin for their assistance in sample acquisition, as well as Laura Lee Rutherford for their assistance in sampling and molecular analyses. We would also like to thank Sarah Owens from Argonne National Lab for microbiomic sample preparation and sequencing. These investigations were supported equally by the Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 and “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate SolutionMPBio6570-205Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)Qiagen990394For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

Références

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