JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Özet

DNA ekstraksiyon protokolleri etkisi araştırıldı edilen numune tipine ve uygulanan aşağı doğru analiz tipleri, hem yüksek ölçüde bağlı olabilir. Yeni bakteriyel topluluk analizi teknikleri (örneğin, microbiomics, metagenomik) kullanımı bu disiplinler içinde tarım ve çevre bilimleri ve birçok çevresel örneklerde daha yaygın hale geliyor düşünüldüğünde physiochemically ve mikrobiyolojik (benzersiz örn, fekal ve çöp / çarşaf örnekleri olabilir kümes hayvanları üretim spektrumu), uygun ve etkili DNA ekstraksiyon yöntemleri dikkatle seçilmiş gerekir. Bu nedenle, yeni bir yarı-otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi çevre kanatlı üretim örnekleri ile kullanılmak için özel olarak geliştirilmiştir. Mekanik ve enzimatik: Bu yöntem, DNA ekstraksiyonu iki temel tür bir kombinasyonudur. Bir iki adım yoğun mekanik homojenizasyon adımı (kullanarak boncuk-yenerek özellikle ÇEVREYLE için formüledışkı örnekleri örnek matris bakterilerin uzaklaştırılması ve DNA geliştirmek ve Gram-pozitif bakteri topluluk üyelerinin kurtarma geliştirmek için tal örnekleri) "altın standart" enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemi başında eklenmiştir. Hibrid yöntemi enzimatik ekstraksiyon kısmı başlatıldı sonra, kalan saflaştırma işlemi numune verimi arttırmak ve örnek işleme hatayı azaltmak için bir robot iş istasyonu kullanılarak otomatik edildi. Kanatlı dışkı ve çöp örnekleri işlerken katı mekanik ve enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yeni hibrid yöntemi nicel dikkate iyi genel kombine performansı, toplam bakteri topluluklarının tahminleri (microbiomics kullanarak) (16S rRNA qPCR kullanarak) ve nitel sağlanan .

Giriş

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)7, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)8, and phylogenetic microarrays9. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic12,13 or microbiomic14 questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency9, DNA yield/quality1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Çevre Kanatlı Üretim Örnekleri 1. Mekanik Homojenizasyon

  1. Ekstre önce, 95 ° C'ye kadar bir su banyosu ve bu, su banyosu zaman bu ısıya varılması için izin verir.
  2. 2 ml Parçalama Matrisi e tüpüne toprak veya dışkı maddesinin 0.33 g tartılır.
    1. Bu tüpün kapasitesini aşan için aşağıdaki çözümleri neden olacağından, tüp numune 0.33 g aşmayın.
    2. RT çözülme dondurulmuş örnekler ağırlığında önce.
    3. Toprak / dışkı 1 g toplam analiz etmek için, dışarı 3 tartmak her çevresel numune için 0.33 gr örnekleri çoğaltmak.
    4. Ekstre etmeden önce konik matris, boruların içinde -20 ° C'de saklayın örnekleri, gerekirse.
  3. 825 ul Sodyum Fosfat Tampon ve örnek bir tüpe PLS çözeltisi 275 ul ekleyin. ~ 15 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın ve daha sonra 5 dakika için 14,000 x g'de örnekleri santrifüj.
  4. Superna Durusutant Tampon ASL 700 ul ekleyin ve. 5 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın.
    1. Tepeboşluğu bu noktada konik tüp mevcut (~% 10, toplam hacim) olduğundan emin olun. Herhangi bir tepe boşluğu varsa, borular çapraz kontaminasyon ve / veya örnek kaybına neden olabilir sonraki homojen hale getirme adımı sırasında sızıntı eğilimi olacaktır.
  5. Bir FastPrep 24 Aracı içine örnekleri yerleştirin ve 40 saniye boyunca 6.0 m / sn hızında örnekleri homojenize.
  6. 5 dakika boyunca 14.000 xg'de homojenize örnek santrifüjleyin. Steril 2 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
  7. Örnekten DNA kurtarma maksimize etmek için, tekrar aynı steril, 2 ml mikrosantrifüj tüp içine süpernatantlar birleştirerek, 1,4-1,6 adımları.

Örnek homojenatlarında İnhibitörlerinin 2. enzimatik inhibisyonu

NOT: Bu protokol QIAamp DNA Tabure Mini Kit kullanır.

  1. Kuluçkaya yatmak5 dakika süre ile 95 ° C su banyosu içinde yüzer yüzer içinde herhangi bir kalan hücreler DNA geri kazanımı maksimize etmek.
    1. Çoğunlukla, Gram-negatif organizmalar içeren örneklerin, 70 ° C'de inkübe edilir. Gram-pozitif organizmalar (kanatlı dışkı örneklerinde olduğu) mevcut olan, ancak, 95 ° C de inkübe edilir.
    2. Basınç bu mühürlü mikrosantrifüj tüplerinde kurmak gibi tüpler açık "pop" olmaz emin ve potansiyel örnek hacmi kaybetmek mikrosantrifüj tüpleri plastik kilitleme klipleri kullanın.
  2. Basınç, yeniden kap mikrosantrifüj tüpleri bırakın ve 15 saniye için bir girdap kullanarak karıştırmak için her mikrosantrifüj tüp açın.
  3. , 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin süpernatan 1.2 mi çıkarmak ve yeni bir 2 ml'lik steril mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin.
  4. Her bir numune için 1 Inhibitex sekmesine ekleyin ve örnek bir homojen beyaz / kirli beyaz bir sıvı haline gelene kadar bir girdap kullanarak karıştırın.
    1. T kaçınınnumuneyi içeren mikrosantrifüj tüp içine yerleştirirken Inhibitex sekmesini ouching. Bunu gerçekleştirmek için, açık mikrosantrifüj tüp üzerinde doğrudan sekmesini içeren blister paketi yerleştirin ve yavaşça kabarcık paketinin dışında ve mikrosantrifüj tüpe sekmesini itin.
  5. 5 dakika boyunca 14.000 x g'de oda sıcaklığında (-25 ° C), 1 dakika için örnek ve santrifüj inkübe edin.
  6. 5 dakika için 14,000 x g'de bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj tüm sıvı aktarın.
    1. Sıvı aktarımı sırasında adım 2.5 sonunda mikrosantrifüj tüpü altındaki topak olabilecek herhangi bir diğer parçacık kaçının.

Qiacube süreci Robotik Workstation Kullanımı 3. Otomatik DNA Saflaştırma

Not: plastik sarf sayısı, santrifüj içinde deneme türbin çarkına adaptörleri düzenlenmesi, ve tamponlar / solüsyonlar gerekli hacimleri, num bağlıdırçalışma ediliyor örneklerin ber.

  1. Rotor adaptörleri içinde uygun yuvalara elüsyon tüpleri ve filtre tüpleri ekleyin. Her numune için, rotorun adaptörün orta yuvaya 400 ul ekle. Numune sayısı arıtıldıktan göre doğru düzende iş istasyonu santrifüj rotor adaptörleri yerleştirin.
    1. Bir başarısızlık arıtma protokolünün santrifüj adımlarından biri sırasında kesme neden olabilir bunu beri mikrosantrifüj tüp kapakları tüm düzgün rotor adaptörü içinde güvenli olduğundan emin olun.
  2. Iş istasyonuna 1.000 ul ve 200 ul filtre ipuçları gerekli sayıda ekleyin ve tamponların gerekli hacmi ile birlikte tampon şişeleri doldurmak.
    NOT: Bu arıtma protokolü (AL, AW1, AW2 ve AE) için gerekli tamponlar tüm QIAamp DNA Tabure Mini Kit içinde yer alır. Kullanıcı AW met için gerekli olan% 100 etanol tedarik gerekiyorffers ve arıtma işleminde kullanılan bir solüsyon olabilir.
  3. Bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine verilen proteinaz K çözeltisi gerekli hacmi ekleyin ve iş istasyonu üzerinde yuva A içine yerleştirin. Ayrıca, iş istasyonunun çalkalama bölümüne 2 ml güvenli kilit mikrosantrifüj örnek tüpleri RB (saflaştırılmış olan örneklerin sayısına eşit) gerekli numarayı ekleyin.
    1. Örnek tüplerin kapakları sıkıca makine başlangıçta gerekli tüm plastik ve sıvılar talep için kullanılabilir olduğundan emin olmak için iş istasyonu tararken bir hata neden olur bunu bir başarısızlık beri, iş istasyonunda uygun yuvalara yerleştirilir emin olun koşmak.
  4. Patojen Algılama Protokolü ve iş istasyonu doğru yüklendiğini emin sonraki ekranlar aracılığıyla okuma - İnsan Tabure - iş istasyonunda dokunmatik ekranı kullanarak, DNA Tabure seçin. Bir kez tüm onay ekranları bu protokolü çalıştırmak için, Başlat geçirilir.
    1. 12'den fazla örneklerinden DNA ayıklanması ise 12 numune bir çalışma iş istasyonunda tamamlamak için ~ 72 dk sürer, çünkü, numunelerin sonraki seti için homojenizasyon işlemi (Adım 1) başlar.
  5. Sonraki mansap analizler için gerekli olana kadar -20 ° C'de, rotor adaptörleri numune kaldırmak, onları kap, ve yer.
    1. Bu noktada, bir santrifüjleme / buharlaştırma tabanlı sistemi kullanılarak tek bir numune (toplam analiz miktarı = 1 g), 3 suret saflaştınlmasını birleştirir. Tris-EDTA tampon maddesi içinde 100 ul bir son hacme çoğaltır ve yeniden elüte birleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışma için, taze dışkı pisliği ve çöp örnekleri güneydoğu ABD'de ticari broiler evi (~ 25.000 kuş) elde edildi. piliçler (Gallus gallus) Cobb-500 haçlar vardı ve onlar örnekleme zamanında 59 gün eski. Taze dışkı ve çöp örnekleri (waterer / besleyici hatları arasında, waterer / besleyici hatlarının yakınında, soğutma pedi yakın ve egzoz fanları yakın) evin içinde dört farklı alanda kurtarıldı ve bu alanların her birinden örnekler toplanmış beş içeriyordu bu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi örneği daha önce 1,3,6 görülen DNA ekstraksiyon yöntemleri bağımlı doğasını analiz destekleyen, hem dışkı ve çöp örneklerin nicel ve nitel toplam bakteri topluluğu tahminleri etkilemiştir. Dışkı ve çöp numuneler hem için, DNA ekstraksiyon yöntemleri performans sırası nicel (Mekanik> Hybrid> Enzimatik) ve nitel (enzimatik> Hybrid> Mekanik) toplam bakteri topluluğu tahminleri için farklı oldu. Melez yöntem yüksek nicel veya nite...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

The authors would like to acknowledge Latoya Wiggins and Katelyn Griffin for their assistance in sample acquisition, as well as Laura Lee Rutherford for their assistance in sampling and molecular analyses. We would also like to thank Sarah Owens from Argonne National Lab for microbiomic sample preparation and sequencing. These investigations were supported equally by the Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 and “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate SolutionMPBio6570-205Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)Qiagen990394For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

Referanslar

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 94DNA ekstraksiyonk mes hayvanlarevred kpyar otomatikmicrobiomicsqPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır