家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

要約

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

要約

DNA抽出プロトコールの有効性が検討されて試料の種類とを行う下流の分析の両方のタイプに大きく依存することができる。新しい細菌群集解析技術（ 例えば、microbiomics、メタゲノミクス）の使用は、農業と環境科学に普及してきており、これらの分野内の多くの環境試料は、物理化学的に及び微生物学的に一意であることができることを考えると（ 例えば、糞便およびリットル/寝具サンプルから家禽生産スペクトル）、適切かつ効果的なDNA抽出法を慎重に選択する必要がある。したがって、新規な半自動ハイブリッドDNAの抽出方法は、環境家禽生産サンプルで使用するために開発された。機械的および酵素：この方法は、DNA抽出の2つの主要なタイプの組み合わせである。特に環境に関する用に製剤化ビーズビーティングを用いた2段階の強い機械的均質化工程（タルサンプル）、「ゴールドスタンダード」糞便サンプルは、サンプルマトリックスからの細菌およびDNAの除去を促進し、グラム陽性細菌のコミュニティのメンバーの回収率を向上させるための酵素DNA抽出方法の初めに添加した。ハイブリッド方式の酵素抽出部が開始された後、残りの精製プロセスは、サンプルのスループットを増大させ、試料処理エラーを減少させるために、ロボットワークステーションを使用して自動化した。定量的な（16S rRNAを定量PCRを用いて）および定性的を考慮した場合、厳格な機械的および酵素的DNA抽出法と比較して、この新規なハイブリッド方法は、（microbiomicsを使用して）最高の全体的な組み合わせの性能を提供し、総細菌群集の推定家禽の糞及びリターサンプルを処理する際に。

概要

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples^1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)^4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)⁷, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)⁸, and phylogenetic microarrays⁹. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples^10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic^12,13 or microbiomic¹⁴ questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis^15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples^1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples^8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency⁹, DNA yield/quality^1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage^5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results^6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

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プロトコル

環境家禽生産試料の1。機械的均質化

1. 抽出前に、95℃の水浴を設定し、水浴時間がその温度に到達させる。
2. 2ミリリットルライジングマトリックスEチューブに土壌や糞便材料の0.33グラムを秤量。
   1. これは、チューブの容量を超えるには、次の解決策の原因となりますので、チューブ内の試料の0.33グラムを超えないようにしてください。
   2. 計量前のRTに凍結サンプルを解凍する。
   3. 土壌/糞便1gの合計を分析するために、各個々の環境サンプルのための3レプリケート0.33グラムのサンプルを秤量。
   4. 抽出前に円錐形の行列チューブ内の-20℃で保存サンプルは、必要に応じて。
3. サンプルチューブに825μlのリン酸ナトリウム緩衝液およびPLS溶液を275μLを加える。 〜15秒間ボルテックスを用いて混合した後、5分間14000×gでサンプルを遠心する。
4. supernaをデカントTANTおよびバッファASLの700μlを添加する。 5秒間ボルテックスを用いて混ぜる。
   1. ヘッドスペースは、この時点で円錐管で利用可能（〜10％の総量）があることを確認してください。ヘッドスペースがない場合には、チューブは、交差汚染および/または試料の損失につながる可能性があり、次の均質化工程中に漏れる傾向を有する。
5. ファストプレップ24インストゥルメントにサンプルを置き、40秒間6.0メートル/秒の速度でサンプルを均質化する。
6. 5分間14000×gで均質化されたサンプルを遠心。無菌の2ミリリットルの微量遠心チューブに上清を移し。
7. サンプルからのDNAの回収を最大にするために、繰り返し同じ滅菌2mlのマイクロ遠心チューブに上清を組み合わせ、1.4~1.6ステップ。

サンプルホモジネートからの阻害剤の2酵素阻害

注：このプロトコルはのQIAamp DNAスツールミニキットを使用しています。

1. インキュベート上清中に残った細胞からのDNAの回収を最大にするため5分間95℃の水浴中で上清。
   1. ほとんどのグラム陰性菌を含む試料を、70℃でインキュベートする。グラム陽性生物（家禽糞便試料の場合である）が存在する場合は、95℃でインキュベートする。
   2. チューブがオープン「ポップ」と、潜在的に圧力などのサンプル量がこれらの密封されたマイクロチューブに構築することができ失わないことを保証するためにマイクロチューブ上のクリップをロックするプラスチックを使用してください。
2. 圧力、再キャップマイクロチューブを解除し、15秒間ボルテックスを用いて混合する各マイクロ遠心チューブを開きます。
3. 、1分間14000×gでサンプルを遠心上清の1.2ミリリットルを削除し、新たな無菌の2ミリリットルマイクロ遠心チューブに入れてください。
4. 各サンプルに1 InhibitExタブを追加し、サンプルが均一に白/オフホワイト液体になるまでボルテックスを用いて混ぜる。
   1. トンを避けるサンプルを含むマイクロ遠心チューブにそれを配置しながらInhibitExタブをouching。これを実現するために、オープンなマイクロ遠心チューブの上に直接タブを含むブリスターパックを置き、静かにブリスターパックから出て、マイクロ遠心チューブにタブを押してください。
5. 5分間14000×gでRT（〜25℃）で1分間のサンプルと遠心をインキュベートします。
6. 5分間14000×gでの滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブと遠心分離機にすべての液体を転送します。
   1. 液体を転送する際にステップ2.5の終了時にマイクロ遠心管の底にペレット化した可能性が残っている粒子状物質を避けてください。

QIAcubeロボットワークステーションを使用して3.自動DNA精製

注：プラスチック消耗品の数、遠心分離機内のサンプルローター·アダプターの配置、およびバッファ/ソリューションの必要なボリュームがNUMに依存している実行されているサンプルのBER。

1. ローター·アダプター内の適切なスロットに溶出チューブとフィルタチューブを追加します。各サンプルについて、ローターアダプタの中央のスロットに400μlを添加する。精製されるサンプルの数に応じて適切な配置で、ワークステーションの遠心分離機ロータアダプタを置きます。
   1. そうしないと、障害が精製プロトコルの遠心分離工程のうちの1つの間にせん断につながる可能性があるので、マイクロ遠心チューブの蓋のすべてが適切にローターアダプタ内に固定されていることを確認します。
2. ワークステーションに千μLと200μlのフィルターチップの必要数を追加し、バッファの必要量と供給バッファーボトルを埋める。
   注：この精製プロトコル（AL、AW1、AW2、及びAE）に必要なバッファがすべてのQIAamp DNAスツールミニキット内に含まれています。ユーザはAW府のために必要とされる100％エタノールを供給する必要がffers及び精製工程に用いられる溶液として。
3. 無菌の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ内に供給さプロテイナーゼK溶液の必要量を追加して、ワークステーション上のスロットAにそれを置く。また、ワークステーションのシェーカーセクションに2ミリリットル安全ロック微量サンプルチューブRBの（精製されたサンプルの数に等しい）に必要な数を加える。
   1. マシンが最初に必要なすべてのプラスチックと液体が要求されたために利用可能であることを確認するためにワークステーションをスキャンするときにこれを行うには失敗がエラーになりますので、サンプル管の蓋がしっかりと、ワークステーション上の適切なスロットに配置されていることを確認してください実行。
4. ワークステーション上でタッチスクリーンを使用して、DNAスツールを選択 - 人間スツール - 病原体検出プロトコル、およびワークステーションが正しくロー​​ドされたことを確実にするために、後続の画面をお読みください。いったんすべてのチェック画面が渡され、このプロトコルを実行するために、開始を選択します。
   1. 12以上のサンプルからDNAを抽出した場合は12個のサンプルの実行がワークステーション上で完了するために〜72分かかるため、サンプルの次のセットのための均質化処理（ステップ1）を開始します。
5. その後の下流の分析に必要とされるまで-20℃で、ローター·アダプターからサンプルを削除し、それらをキャップ、と場所。
   1. この時点で、遠心分離/蒸発ベースのシステムを使用して個々のサンプル（合計で分析量= 1グラム）のための3の反復精製を兼ね備えています。トリスETDAバッファー100μlの最終容量に複製し、再溶出を組み合わせる。

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結果

この研究では、新鮮な糞便糞とゴミサンプルは、米国南東部の商業ブロイラーハウス（〜25000羽）から回収した。ブロイラーは（ セキショクヤケイ ）コブ-500が交差した、と彼らはサンプリング時に59日齢であった。新鮮糞便及びリターサンプルは（冷却パッドの近くに、給水器/給電線の近くに、給水器/給電線との間に、排気ファンの近く）ハウス内の4つの領域から回収し、そしてこ...

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ディスカッション

使用したDNA抽出法の両方糞便やごみの試料について定量的および定性的全細菌コミュニティの見積もりを行うこと、試料を支持することは、以前に^1,3,6見られるDNA抽出法の依存性を分析します。糞とゴミサンプルの両方のために、DNA抽出方法の性能の順序は、定量的（機械>ハイブリッド>酵素）と定性的な（酵素>ハイブリッド>機械）全細菌コミュニティの見積もりの​​た?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysing Matrix E tube	MPBio	6914-050	Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate Solution	MPBio	6570-205	Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS Buffer	MPBio	6570-201
Buffer ASL (560 ml)	Qiagen	19082
FastPrep 24 homogenizer	MPBio	116004500	48 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini Kit	Qiagen	51504
QIAcube24 (110V)	Qiagen	9001292	Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)	Qiagen	990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)	Qiagen	990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)	Qiagen	990394	For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)	Qiagen	990381	Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352