JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Abstract

היעילות של פרוטוקולי מיצוי DNA יכולה להיות תלויה במידה רבה על שני הסוג של מדגם נחקר והסוגים של ניתוחים שבוצעו במורד הזרם. בהתחשב בכך שהשימוש בטכניקות חדשות ניתוח קהילת חיידקים (למשל, microbiomics, metagenomics) הופך נפוץ יותר במדעי החקלאות ואיכות הסביבה, ורבים דגימות סביבתיות בתוך דיסציפלינות אלה יכולים להיות physiochemically וmicrobiologically ייחודי (לדוגמא, צואה ודגימות חול / מצעים מ ספקטרום ייצור העופות), שיטות מיצוי DNA מתאימות ויעילות צריכה להיות שנבחרו בקפידה. לכן, שיטת מיצוי DNA ההיברידי אוטומטית-למחצה רומן פותחה במיוחד לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיים. שיטה זו היא שילוב של שני סוגים העיקריים של מיצוי DNA: מכאני והאנזימטית. צעד הומוגניזציה מכאנית אינטנסיבי דו-שלבים (באמצעות חרוז הכאה גיבש במיוחד עבור לסביבהדגימות טל) התווספה לתחילתה של השיטה "תקן זהב" האנזימטית מיצוי DNA לדגימות צואה כדי לשפר את ההסרה של חיידקים וDNA ממטריצת המדגם ולשפר את ההתאוששות של חברי קהילת חיידקים גראם-חיוביים. ברגע שחלק החילוץ האנזימטית של השיטה ההיברידית יזם, תהליך הטיהור שנותר היה אוטומטי באמצעות תחנת עבודה רובוטית כדי להגדיל את התפוקה ולהפחית מדגם מדגם שגיאת עיבוד. בהשוואה לשיטות מיצוי DNA המכנית והאנזימטית הקפדניות, השיטה ההיברידית הרומן הזה סיפק את הביצועים הטובים ביותר בשילוב כולל כאשר שוקלים כמותי (באמצעות 16S rRNA qPCR) ואיכותי (באמצעות microbiomics) ערכות של קהילות חיידקים הכוללת עת עיבוד צואת עופות ודגימות חול .

Introduction

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)7, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)8, and phylogenetic microarrays9. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic12,13 or microbiomic14 questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency9, DNA yield/quality1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Homogenization מכאני של דוגמאות ייצור עופות הסביבה

  1. לפני המיצוי, להגדיר אמבט מים עד 95 ° C ולאפשר זמן אמבט מים כדי להגיע לטמפרטורה זו.
  2. לשקול את 0.33 גרם של אדמה או חומר צואתי לתוך צינור lysing מטריקס E 2 מיליליטר.
    1. לא יעלה על 0.33 גרם של מדגם בצינור, שכן זה יגרום הפתרונות הבאים למעבר לקיבולת של הצינור.
    2. דגימות הפשרה קפוא לRT לפני השקילה.
    3. על מנת לנתח את כולל של 1 גרם של אדמה / צואה, שוקל 3 מ- לשכפל 0.33 דגימות g עבור כל דגימה סביבתית בודדת.
    4. חנות דגימות ב -20 ° C בתוך צינורות מטריצת חרוטי לפני המיצוי, במידת צורך.
  3. להוסיף 825 μl סודיום פוספט הצפת וμl 275 של פתרון PLS לצינור מדגם. מערבבים בעזרת מערבולת ל~ 15 שניות ואז צנטריפוגות הדגימות 14,000 XG במשך 5 דקות.
  4. למזוג supernatant ולהוסיף 700 μl של הצפת ASL. מערבבים בעזרת מערבולת במשך 5 שניות.
    1. ודא שיש אמיץ (10% נפח כולל ~) זמין בצינור חרוטי בשלב זה. אם אין אמיץ, הצינורות יהיו נטייה לדלוף במהלך שלב הומוגניזציה הבא שעלולות להוביל לזיהום צולב ו / או הפסד מדגם.
  5. מניחים את הדגימות למכשיר 24 FastPrep, וhomogenize הדגימות במהירות של 6.0 מ '/ שנייה למשך 40 שניות.
  6. צנטריפוגה המדגם הומוגני 14,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר סטרילי.
  7. על מנת למקסם את התאוששות DNA מן המדגם, חזור על שלבים 1.4-1.6, המשלבים את supernatants לתוך צינור microcentrifuge, 2 מיליליטר סטרילי.

2. אנזימתי עיכוב של המעכבים מhomogenates לדוגמא

הערה: פרוטוקול זה משתמש בערכת QIAamp DNA הצואה Mini.

  1. דגירהsupernatant באמבט מים C ° 95 במשך 5 דקות על מנת למקסם את התאוששות DNA מכל תאים שנותרו בתוך supernatant.
    1. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך דגימות המכילות אורגניזמים בעיקר גראם שליליים. עם זאת, אם אורגניזמים גראם חיוביים נמצאים (שהוא במקרה עם דגימות צואה עופות), דגירה על 95 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש בקליפים פלסטיק נעילה על צינורות microcentrifuge כדי להבטיח שהצינורות לא "פופ" פתוחים ואפשרות לאבד נפח דגימה כלחץ יכול להצטבר בצינורות microcentrifuge האטומים אלה.
  2. פתח כל צינור microcentrifuge כדי לשחרר את הלחץ, צינורות microcentrifuge מחדש כובע ומערבבים בעזרת מערבולת במשך 15 שניות.
  3. צנטריפוגה מדגם 14,000 XG דקות 1, להסיר 1.2 מיליליטר של supernatant ולמקם אותו לתוך צינור סטרילי חדש 2 מיליליטר microcentrifuge.
  4. הוסף 1 כרטיסיית InhibitEx מדגם זה, ומערבבים בעזרת מערבולת עד המדגם הופך נוזל אחיד לבן / off-לבן.
    1. הימנע touching כרטיסיית InhibitEx תוך שימה אותו לתוך צינור microcentrifuge המכיל את המדגם. כדי להשיג זאת, הנח את חבילת השלפוחית ​​המכילה את הכרטיסייה ישירות על צינור microcentrifuge הפתוח ודחף בעדינות את הכרטיסייה מחפיסת השלפוחית ​​ולתוך צינור microcentrifuge.
  5. דגירה המדגם 1 דקות בRT (~ 25 מעלות צלזיוס) וצנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
  6. להעביר את כל הנוזל לצינור סטרילי 1.5 מיליליטר microcentrifuge ו צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 5 דקות.
    1. הימנע מכל חלקיקים שנותרו שאולי pelleted בתחתית צינור microcentrifuge בסוף השלב 2.5 בעת העברת הנוזל.

3. אוטומטי DNA טיהור באמצעות QIAcube רובוטית Workstation

הערה: מספר מתכלה פלסטיק, ההסדר של מתאמי הרוטור מדגם בתוך צנטריפוגות, וכרכים הנדרשים ממאגרים / הפתרונות תלויים בnumבער של דגימות שמתנהלות.

  1. להוסיף צינורות elution וצינורות מסנן לחריצים המתאימים במתאמי הרוטור. עבור כל דגימה, להוסיף 400 μl לחריץ אמצע מתאם הרוטור. הנח את מתאמי הרוטור בצנטריפוגה תחנת העבודה בהסדר הנכון בהתאם למספר הדגימות מטוהר.
    1. ודא שכל מכסי צינור microcentrifuge מאובטחים כראוי בתוך מתאם הרוטור מאז כישלון לעשות זאת עלולה לגרום לגז באחד משלבי צנטריפוגה של פרוטוקול הטיהור.
  2. הוסף את המספר הדרוש של 1,000 μl ו -200 μl מסנן-טיפים לתחנת העבודה, ולמלא את בקבוקי חיץ המסופקים עם הנפח הנדרש לאחסון.
    הערה: כל המאגרים הנדרשים לפרוטוקול טיהור זה (AL, AW1, Aw2, וAE) נמצאים בתוך ערכת QIAamp DNA הצואה Mini. המשתמש צריך לספק אתנול 100% מה שצריך לbu AWffers וכפתרון המשמש בתהליך הטיהור.
  3. הוסף את הנפח הנדרש של פתרון K proteinase סיפק לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל ומניח אותו לחריץ בתחנת העבודה. כמו כן, להוסיף את המספר הנדרש (שווה למספר של דגימות מטוהרות) של RB צינורות מדגם microcentrifuge בטוח נעילת 2 מיליליטר לסעיף שייקר של תחנת העבודה.
    1. ודא שהמכסים של צינורות המדגם ממוקמים באופן מאובטח לחריצים המתאימים בתחנת העבודה, מאז כישלון לעשות זאת תגרום לשגיאה כאשר המכונה בתחילה סורק את תחנת העבודה כדי לוודא שכל הפלסטיק והנוזלים הדרושים זמינים לבקש לרוץ.
  4. שימוש במסך המגע בתחנת העבודה, בחר בצואת DNA - צואה אדם - פתוגן איתור פרוטוקול, וקרא במסכים הבאים כדי להבטיח שתחנת העבודה הייתה טעונה בצורה נכונה. ברגע שכל מסכי הבדיקה מועברים, בחר התחל לרוץ בפרוטוקול זה.
    1. אם חילוץ DNA יותר מ 12 דגימות, להתחיל בתהליך הומוגניזציה (שלב 1) לסדרה הבאה של דגימות, מאז ריצה של 12 דגימות לוקחת ~ 72 דקות כדי להשלים בתחנת העבודה.
  5. הסר את הדגימות ממתאמי הרוטור, כובעם, ומקום ב -20 ° C עד צורך לניתוחים במורד הזרם שלאחר מכן.
    1. בשלב זה, לשלב את purifications לשכפל 3 למדגם בודד (סכום כולל = 1 גרם ניתחו) באמצעות מערכת צנטריפוגה / מבוסס אידוי. מערבבים את משכפל מחדש elute לנפח סופי של של חיץ טריס-ETDA 100 μl.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במחקר זה, גללי צואה טריים ודגימות חול שהתאוששו מבית מסחרי פטם (~ 25,000 ציפורים) בדרום-מערב ארה"ב. הפטמים (גאלוס גאלוס) היו קוב-500 חוצים, והם היו בני 59 ימים בזמן הדגימה. דגימות צואה וחול טריות היו התאוששו מארבעה אזורים שונים בתוך הבית (ליד קירור כרית, בקרבת קווי Waterer / ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטת מיצוי DNA משמשת בוצעה הערכות חיידקים כוללת כמותיים ואיכותיות הקהילה לשתי דגימות הצואה והמלטה, התומך במדגם מנתח טבע תלוי בשיטות מיצוי DNA ראה בעבר 1,3,6. עבור שני דגימות צואה והמלטה, סדר ביצועים של שיטות מיצוי DNA היה שונה עבור כמותית (מכאני> היברידי> אנזימתי) ו(...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Latoya Wiggins and Katelyn Griffin for their assistance in sample acquisition, as well as Laura Lee Rutherford for their assistance in sampling and molecular analyses. We would also like to thank Sarah Owens from Argonne National Lab for microbiomic sample preparation and sequencing. These investigations were supported equally by the Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 and “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate SolutionMPBio6570-205Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)Qiagen990394For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

References

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

94DNAmicrobiomicsqPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved