JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Аннотация

Эффективность протоколов выделения ДНК может быть очень зависит как от типа образца изучается и типов ниже по течению анализов, выполненных. Учитывая, что использование новых методов анализа бактериальное сообщество (например, microbiomics, Метагеномика) становится все более распространенным в сельскохозяйственных и экологических наук и многих проб окружающей среды в рамках этих дисциплин может быть физико-химически и микробиологически уникальный (например, фекальные и образцы помета / постельные принадлежности от птицеводства спектр), надлежащие и эффективные методы выделения ДНК должны быть тщательно подобраны. Таким образом, роман полуавтоматический метод извлечения гибридная ДНК была разработана специально для использования с образцами производства на окружающую птицы. Этот метод является комбинацией двух основных типов выделения ДНК: механические и ферментативных. Двухступенчатый интенсивный ступенчатой ​​механической гомогенизации (с помощью валика избиение специально разработан для Environmenтий) был добавлен в начале "золотого стандарта" ферментативного способа экстракции ДНК образцы фекалий для повышения удаление бактерий и ДНК из матрицы образца и улучшить восстановление грамположительных членов бактериальных сообществ. После того, как ферментативная добыча часть гибридного метода была начата, оставаясь Процесс очистки автоматизирован с использованием роботизированной рабочей станции увеличить пропускную способность и уменьшить ошибку обработки образца. По сравнению с жесткими механическими и ферментативных методов извлечения ДНК, этот роман гибридный метод обеспечивает наилучшее общее совместное выступление при рассмотрении количественных (с использованием 16S рРНК кПЦР) и качественную (с использованием microbiomics) оценки общего бактериальных сообществ при обработке мяса птицы фекалии и образцы для мусора ,

Введение

When analyzing complex clinical or environmental samples (e.g., feces, soils), there are two main methodologies used for the extraction of DNA. The first is a mechanical disruption of the matrix using an intense bead-beating step, while the second is an enzymatic disruption of the matrix to chemically release bacterial cells and inhibit PCR inhibitors from the matrix simultaneously. Given the different means by which these two types of extraction methods work, it is not surprising that previous studies demonstrated that the appropriate DNA extraction method is both highly sample and analysis dependent. Comparative DNA extraction studies previously showed that some methods are more appropriate for improved DNA quality and quantity from environmental samples1-3, while others demonstrated improvements for community-level analyses such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)4-6, terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP)7, automated ribosomal intergenic spacer analysis (ARISA)8, and phylogenetic microarrays9. Therefore, appropriate DNA extraction methods need to be used, or developed, according to the types of environmental samples and the types of analyses being performed on those samples, especially given the recent advancements in bacterial community analyses.

Next generation sequencing, in conjunction with more quantitative community assessments (e.g., quantitative PCR (qPCR)), is becoming more prevalent in the environmental and clinical sciences, however, very little research has been performed to determine the effect of DNA extraction methods on these data sets. Most DNA extraction comparison studies dealt with microbiomic community estimates from human or human model samples10,11, not agricultural animal samples. The few poultry-focused next generation sequencing studies dealt with specific metagenomic12,13 or microbiomic14 questions; they did not discuss the effect of DNA extraction method on the resulting microbiomic analyses. Considering the complex nature of environmental samples related to poultry production (e.g., feces, litter/bedding, pasture soil), DNA extraction methods need to be carefully selected. Poultry-related environmental samples are known to contain large numbers of PCR inhibitors and up to 500-fold DNA extract dilutions have been required for PCR and subsequent downstream analysis15-17. Therefore it is essential that DNA extraction methods be optimized for these types of samples in order to not only physically disrupt the matrix, but also to be able to reduce/eliminate the large number of inhibitors that are present.

The QIAamp DNA Stool Mini Kit, an enzymatic extraction method, has been considered the “gold standard” when extracting DNA from difficult gut/fecal samples1,18,19 and has been applied successfully to poultry environmental samples8,14. The enzymatic removal of PCR inhibitors through the use of a proprietary matrix is one of the greatest advantages of using this method for these types of environmental samples, as is the ability to significantly improve throughput (and reduce sample processing error) using automated workstations. One major disadvantage is the lack of a mechanical homogenization step to physically disassociate bacterial cells from the environmental matrix. When testing gut and fecal samples of non-poultry origin, the addition of a bead-beating or mechanical disruption step within a DNA extraction protocol significantly increased extraction efficiency9, DNA yield/quality1,4,5 and significantly improved downstream community analyses in terms of richness, diversity, and coverage5,6,11. These studies compared not only mechanical bead-beating methods to the “gold standard” enzymatic method, but some also added the mechanical bead-beating step to the enzymatic protocol to improve results6,9,11.

According to the results from the above studies, bacterial community analyses (both qualitative and quantitative) could be improved from poultry-related environmental samples through the addition of a mechanical homogenization step to the enzymatic method. Therefore, the goal of this study was twofold: (1) to develop a novel DNA extraction technique that utilizes the most desirable aspects of both the mechanical (powerful homogenization step) and enzymatic (PCR inhibitor removal and automation) extraction methods and (2) compare the quantitative (via qPCR) and qualitative (via microbiomics) bacterial community assessments of this novel method to representative mechanical and enzymatic methods.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Механическая Гомогенизация окружающей среды птица Образцы продукции

  1. Перед экстракцией, установлен на водяной бане до 95 ° С и позволяют время на водяной бане, чтобы достичь этой температуры.
  2. Взвесить 0,33 г почвы или фекального материала в 2 мл Lysing матрицы Е трубки.
    1. Не превышайте 0,33 г образца в трубке, так как это вызовет следующие решения превышать пропускную способность трубы.
    2. Оттепель замороженные образцы до комнатной температуры перед взвешиванием.
    3. Для анализа в общей сложности 1 г почвы / кал, отвесить 3 репликации 0,33 г образцов для каждого отдельного окружающей образец.
    4. Магазин образцы при -20 ° С в течение конических труб матричных перед экстракцией, если это необходимо.
  3. Добавить 825 мкл натрий фосфатного буфера и 275 мкл раствора PLS к пробирку. Смешайте использованием вихревой за ~ 15 сек, а затем центрифуги образцов при 14000 х г в течение 5 мин.
  4. Слейте supernaдаря добавить 700 мкл буфера ASL. Смешайте с использованием вихрь в течение 5 сек.
    1. Убедитесь, что имеется свободное пространство (~ 10% от общего объема) доступны в конической трубе в этой точке. Если нет свободного пространства, трубы будут иметь тенденцию к протеканию во время следующей стадии гомогенизации, которая может привести к перекрестного загрязнения и / или потери образца.
  5. Поместите образцы в FastPrep 24 инструмента, и гомогенизировать образцы при скорости 6,0 м / сек в течение 40 сек.
  6. Центрифуга гомогенизированный образец при 14000 х г в течение 5 мин. Передача супернатант в стерильную 2 мл микроцентрифужных трубки.
  7. Чтобы максимизировать восстановление ДНК из образца, повторите шаги 1,4 до 1,6, комбинируя супернатантов в стерильной же, 2 мл микроцентрифужных трубки.

2. Ферментативный Ингибирование ингибиторов от образца гомогенаты

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует QIAamp ДНК стул Mini Kit.

  1. ВыдержитеСупернатант в C водяной бане 95 ° С в течение 5 мин, чтобы максимизировать восстановление ДНК из оставшихся клеток в супернатанте.
    1. Инкубируют при 70 ° С для образцов, содержащих в основном грамотрицательных микроорганизмов. Тем не менее, если грамположительные организмы присутствуют (как это имеет место с образцами птицы фекальных), инкубируют при 95 ° С.
    2. Используйте пластиковые стопорные защелки на микропробирок для того, чтобы трубы не будет "поп" открытым и потенциально теряют объем образца как давление может создать в этих закрытых микропробирок.
  2. Откройте каждый микроцентрифужную трубку, чтобы освободить от давления, повторно колпачок микроцентрифужных пробирок и смешать с использованием вихрь в течение 15 сек.
  3. Центрифуга образца при 14 000 мкг в течение 1 мин, снять 1,2 мл супернатанта и поместите его в новый стерильный 2 мл микроцентрифужных трубки.
  4. Добавить 1 вкладку Inhibitex к каждому образцу, и смешивать с помощью вихря, пока образец не станет равномерно белый / не совсем белого жидкости.
    1. Избегайте тouching вкладку Inhibitex при размещении его в микроцентрифужных трубки, содержащей образец. Чтобы достичь этого, поместить блистерную упаковку, содержащую вкладку непосредственно над открытой трубки микроцентрифужных и осторожно нажать на вкладку из блистерной упаковки и в микроцентрифужных трубки.
  5. Инкубируйте образца в течение 1 мин при комнатной температуре (~ 25 ° С) и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
  6. Передача всю жидкость в стерильную 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 14000 х г в течение 5 мин.
    1. Во избежание любых оставшихся твердых частиц, которые могут быть осаждали в нижней части трубки микроцентрифужных в конце стадии 2,5 при переносе жидкости.

3. Автоматизированная Очистка ДНК с использованием QIAcube Robotic Workstation

ПРИМЕЧАНИЕ: Количество пластиковых расходных материалов, расположение образец ротора адаптерами в центрифуге, а также необходимые объемы Буферы / решений зависит от питчество образцов, которые в настоящее время работают.

  1. Добавить элюирования ламп и фильтрующих труб в соответствующие пазы внутри ротора адаптеров. Для каждого образца, добавить 400 мкл к среднему гнездо адаптера ротора. Поместите ротора адаптеры в рабочей станции центрифуге в правильном расположении в зависимости от числа проб очистки.
    1. Убедитесь, что все крышки трубки микроцентрифужных надежно закреплены в держатель ротора с неспособность сделать это может привести к сдвигу во время одного из этапов центрифугирования протокола очистки.
  2. Добавьте необходимое количество 1000 мкл и 200 мкл фильтр-советы на рабочую станцию, и заполнить предоставленный буфер бутылки с необходимым объемом буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: буферы, необходимые для этого протокола очистки (AL, AW1, AW2 и АЭ) все содержащиеся в QIAamp ДНК стул Mini Kit. Пользователь должен поставить 100% этанола, который необходим для бу AWffers и в виде раствора, используемого в процессе очистки.
  3. Добавьте требуемый объем поставляемого протеиназы решения K в стерильный 1,5 мл трубки микроцентрифужных и поместить его в слот А на рабочей станции. Кроме того, добавить необходимое количество (равное количеству образцов очищается) из 2 мл безопасной блокировки образца микроцентрифужных пробирках RB в разделе шейкер рабочей станции.
    1. Убедитесь, что крышки пробирки с образцом надежно помещаются в соответствующие пазы на рабочей станции, так как неспособность сделать это приведет к ошибке, когда машина первоначально сканирует рабочую станцию, чтобы убедиться, все необходимые пластмасс и жидкости для просили запустить.
  4. Использование сенсорного на рабочей станции, выберите ДНК Стульчик - Человек Стульчик - обнаружение протокола возбудителя и прочитать последующих экранах для того, чтобы станция была загружена правильно. После того как все проверки экраны прошло, выберите Пуск, чтобы запустить этот протокол.
    1. Если экстракции ДНК из более чем 12 образцов, начать процесс гомогенизации (шаг 1) для следующего набора образцов, так как пробег 12 образцов занимает ~ 72 минут, чтобы завершить на рабочей станции.
  5. Удалить образцы из ротора адаптеров, крышка их, и место при температуре от -20 ° С до использования в последующих последующих анализов.
    1. В этот момент, объединить три дублирующие очисток для отдельного образца (общее количество анализировали = 1 г) с использованием / испарения на основе системы центрифугированием. Смешайте повторов и повторного элюата до конечного объема 100 мкл Трис-ЭДТА буфера.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для этого исследования, свежие фекальные помет и образцы помета были извлечены из коммерческих птичника (~ 25 000 птиц) в юго-востоке США. Бройлеров (Gallus Gallus) были Кобб-500 крестов, и они были 59 дней на момент отбора проб. Свежие фекальные и подстилки образцы были извлечены из четырех разл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Метод извлечения ДНК используется осуществляться количественные и качественные общей сметы бактериальные сообщества в отношении фекальных и подстилки образцов, поддерживая анализы проб зависимый характер методов экстракции ДНК видел ранее 1,3,6. Для обоих фекальных и подстилки...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The authors would like to acknowledge Latoya Wiggins and Katelyn Griffin for their assistance in sample acquisition, as well as Laura Lee Rutherford for their assistance in sampling and molecular analyses. We would also like to thank Sarah Owens from Argonne National Lab for microbiomic sample preparation and sequencing. These investigations were supported equally by the Agricultural Research Service, USDA CRIS Projects “Pathogen Reduction and Processing Parameters in Poultry Processing Systems” #6612-41420-017-00 and “Molecular Approaches for the Characterization of Foodborne Pathogens in Poultry” #6612-32000-059-00.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Lysing Matrix E tubeMPBio6914-050Different sizes available and the last 3 numbers of the cat. No. indicate size (-050 = 50 tubes, -200 = 200 tubes, -1000 = 1,000 tubes)
Sodium Phosphate SolutionMPBio6570-205Can be purchased individually, or also contained within the FastDNA Spin Kit for feces (Cat. No. 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adapter (Cat. No. 116002527) available to double throughput of mechanical homogenization step
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Preliminary results show that QIAcube HT (Cat. No. 9001793) can be used to improve throughput, but different consumables are required of this machine and more comparative work needs to be done.
Filter-Tips, 1,000 ml (1024)Qiagen990352
Filter-Tips, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adapters (10 x 24)Qiagen990394For 1.5 ml microcentrifuge tubes included with in the rotor adapter kit there is an alternative.  It is Sarstedt Micro tube 1.5 ml Safety Cap, Cat. No. 72.690
Sample Tubes RB (2 ml)Qiagen990381Alternative: Eppendorf Safe-Lok micro test tube, Cat. No. 022363352

Ссылки

  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

94microbiomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены