قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

Summary

ويتحدد مستوى الدولة المطرد للمن mRNAs محددة من معدل توليف واضمحلال مرنا. معدلات تدهور مرنا على نطاق الجينوم أو معدلات اضمحلال من mRNAs محددة يمكن قياسها من خلال تحديد مرنا نصف العمر. يركز هذا البروتوكول على قياس معدلات تسوس مرنا في خميرة الخباز.

Abstract

مرنا مستويات حالة مستقرة تختلف باختلاف الظروف البيئية. تنظيم مستويات تراكم حالة مستقرة من مرنا يضمن أن المبلغ الصحيح للبروتين يتم تصنيعه لظروف النمو المحددة للخلية. نهج واحد لقياس معدلات تسوس مرنا هو منع النسخ والرصد لاحقا اختفاء مرنا موجودة بالفعل. ويمكن بعد ذلك كميا معدل تسوس مرنا، ودقيقة نصف الحياة ويمكن تحديد ذلك باستخدام عدة تقنيات. في S. الخباز والبروتوكولات التي تقيس مرنا وقد وضعت نصف العمر وتشمل تثبيط النسخ من مرنا باستخدام سلالات التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1. تقنيات أخرى لقياس مرنا نصف حياة تشمل عرقلة النسخ مع مثبطات النسخي مثل thiolutin أو 1،10-phenanthroline، أو بدلا من ذلك، من خلال الاستفادة من mRNAs التي هي تحت سيطرة أحد المروجين regulatableمثل الجلاكتوز المروج محرض وخارج TET النظام. هنا، نحن تصف قياس S. معدلات تسوس الخباز مرنا باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. هذه التقنية يمكن استخدامها لقياس مرنا معدلات اضمحلال من mRNAs الفردية أو على مستوى الجينوم.

Introduction

النسخ واضمحلال مرنا محددة من المحددات الحاسمة في التعبير الجيني. معدل التوليف واضمحلال من mRNAs محددة يحدد مستوى ثابت للدولة من أن مرنا معين. مستويات الحالة المستقرة للمن mRNAs تحكم وفرة من mRNAs وتحديد مقدار كل مرنا هو متاح لتخليق البروتين. وتستخدم قياسات مرنا نصف العمر على نطاق واسع لتحديد معدل اضمحلال من mRNAs. من mRNAs تسوس محددة بمعدلات مختلفة التي ترتبط ملامح مرنا، وظيفة البروتين المشفرة بواسطة مرنا والظروف البيئية. اعتمادا على تقنية تستخدم لتحديد معدلات تسوس مرنا، ويمكن تحديد قياسات معدل التحلل إما على الصعيد العالمي أو النصوص الفردية. في خميرة S. الخباز، والتقنيات التي تستخدم عادة لقياس معدلات تسوس مرنا العالمي وتشمل الاستفادة من سلالة الخميرة إيواء أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني وtransc الكيميائيمثبطات riptional مثل thiolutin و-1،10 phenanthroline ^1-5. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأساليب لقياس معدلات تسوس مرنا الفردية ^4. يمكن أيضا أن تستخدم طرق أخرى لقياس معدلات تسوس مرنا. وتشمل هذه الأساليب نهج لوضع العلامات الدولة ثابت أو استخدام جزيئات الرنا التي يتم التعبير عنها من المروج المنظم الذي يتم التعبير فقط في ظروف محددة. كل من هذه التقنيات لديها مزايا وقيود معينة. تقنية الموضحة هنا تستخدم أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II. وتستخدم هذه الطريقة S. الخباز كنموذج، ولكن يمكن أن يتم تعديلها واستخدامها في أنظمة أخرى باستخدام تقنيات تثبيط النسخي محددة ^6.

مرنا القياسات نصف الحياة باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II وتستخدم على نطاق واسع لكلا القياسات الجينوم على نطاق والفردية من مرنا تسوس ^4-5. تتطلب هذه التقنية استخدام specifجيم سلالة الخميرة التي تؤوي أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، rpb1-1 ^1. الأساس المنطقي لهذه التقنية هو أن التعرض لدرجة الحرارة حساسة سلالة الخميرة لدرجة حرارة nonpermissive يثبط تخليق مرنا. وفي وقت لاحق، ويتم رصد اضمحلال مرنا قبل الإيجاد في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تم مستعمل النسخ. ويتم رصد اختفاء مرنا قبل الإيجاد عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة في نقاط زمنية مختلفة بعد أن تحولت النسخ قبالة. ومحددة سلفا النقاط الوقت الذي يتم حصاد الخلايا الخميرة التي كتبها تجربة رائدة، وتعتمد على النصوص ونظام يجري التحقيق فيها. وتستخدم نقاط زمنية أسرع للنصوص قصيرة الأجل، في حين يتم استخدام نقاط زمنية أطول لالنصوص تعد عاش. بعد ذلك، يتم رصد اضمحلال مرنا إما عن طريق تحليل لطخة الشمالي، PCR الكمي أو RNAseq.

قياس مرنا نصف العمر باستخدام الشركة المصرية للاتصالاتmperature أليل حساسة من RNA البلمرة II مزاياه. أولا، هذه التقنية سهلة ومباشرة إلى الأمام. ثانيا، بمجرد الحصول على سلالة الخميرة أو إنشاء في المختبر يمكن تحديد مرنا القياسات نصف الحياة في ظروف النمو المختلفة. تمكين تحديد التأثير البيئي على تسوس مرنا. ثالثا، يمكن رصد معدلات تسوس مرنا على نطاق الجينوم. استخدام تقنيات النسخ تثبيط الأخرى لديها أيضا مزايا وقيود. على سبيل المثال، استخدام المروج محرض يتطلب استنساخ فرعي لتوليد مرنا التي هي تحت سيطرة المروج المنظم. Thiolutin غير متوفرة بسهولة وغير مكلفة عندما تكون متاحة. وبالإضافة إلى ذلك، ليست مفهومة وضع thiolutin للعمل تماما وتم الإبلاغ عن أن تؤثر على العمليات الخلوية الأخرى بما في ذلك منع تسوس مرنا ^7. بدلا من ذلك، 1،10-phenanthroline، هو أكثر متاحة بسهولة. وعلاوة على ذلك، فإن جميع التقنيات المستخدمة لمنع النسخ يمكن بيرتURB ظيفة الخلوية ويمكن أن تؤثر على المختلف في mRNA في طرق مختلفة. يحتاج محقق لتحديد أنسب طريقة لاستخدام في ظروف تجريبية لتحقيق النتائج الأكثر موثوقية. لتحديد الطريقة التي هي الأكثر ملاءمة لتطبيقها، يحتاج الباحث إلى التعرف على النصوص وظيفة من البروتينات المشفرة بواسطة النصوص التي يجري التحقيق فيها. القياسات معدل تسوس مرنا الأكثر موثوقية هي تلك التي يتم تحديدها باستخدام تقنيات متعددة وتظهر معدل تسوس نفسه. لا تقنية واحدة هي دائما أفضل، والأسلوب الأكثر ملائمة يعتمد على حالة معينة.

العديد من الدراسات في S. الخباز وقياس معدلات تسوس مرنا في مختلف الظروف والخلفيات الوراثية. الظروف أن معدلات تسوس مرنا تقاس في تعتمد على التجربة المحددة التي يجري التحقيق فيها. قياس معدلات تسوس مرنا في بيئات الخلوية المختلفة يحدد ما إذا كان يجري الشروطدرست تؤثر بشكل تفضيلي معدلات اضمحلال من mRNAs محددة. معدلات اضمحلال من mRNAs يمكن أيضا أن تختلف تبعا لسلالة الخميرة المستخدمة. على سبيل المثال، يمكن تحديد معدلات تسوس مرنا في البرية من نوع خلايا الخميرة وخلايا الخميرة مع ظيفي بوساطة هراء تدهور مرنا (NMD) المسار. تم العثور على هذا التدهور مسار مرنا في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة التي تم فحصها حتى الآن وأنه يتسبب في تدهور من mRNAs أن إنهاء قبل الأوان الترجمة ^8. وقد تم تحديد NMD البداية كمسار التي تحط من mRNAs مع كودونات إنهاء المبكرة أو كودونات هراء، ولكن ومن المسلم به الآن كمسار الذي ينظم أيضا التعبير عن عدم هراء التي تحتوي على أنواع من mRNAs الطبيعية. وتدهورت من mRNAs التي هي أهداف للمسار السريع في خلايا الخميرة مع مسار وظيفي NMD واستقرت في خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي. وهكذا، فإن حياة نصف من من mRNAs التي أهدافا مباشرة من هذا المسار هي أقصر في البرية من نوع الخميرة سلليرة سورية مقارنة مع خلايا الخميرة مع مسار NMD غير وظيفي.

Protocol

1. نمو خلايا الخميرة

1. تحديد سلالات الخميرة المناسبة لاستخدامها للقياسات معدل التحلل مرنا. لمنع النسخ باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA البلمرة II، واستخدام سلالات الخميرة إيواء طفرة rpb1-1 ^1. الحصول على هذه السلالة الخميرة من المختبرات التي لديها بالفعل واحدة، أو توليد في المختبر باستخدام تقنيات القياسية إذا كنت بحاجة لخلفية وراثية محددة ^9.
2. باستخدام تقنية معقمة، وإعداد وسائل الاعلام الخميرة باستخدام إجراءات القياسية ^10. إذا كان المطلوب عدم التحديد، وإعداد وسائل الاعلام الغنية مثل YPD. بدلا من ذلك، وإعداد وسائل الإعلام الانتقائي إذا كان مطلوبا تتحول مع البلازميدات واختيار خلايا الخميرة. الأوتوكلاف وسائل الإعلام.
3. تنمو خلايا الخميرة في 28 ° C، الذي هو درجة الحرارة المسموح بها لهذه السلالة الخميرة. هل هذا في خطوتين:
   1. لO الأول / N، وتنمو خلايا الخميرة في 5 مل من وسائط النمو إلى التشبع.
   2. إعداد O الثاني / N في نهاية اليوم الثاني. لO الثاني / N، تطعيم كميات مختلفة من خلايا الخميرة من O الأول / N إلى 100 إلى 150 مل من وسائط النمو (التي تتراوح بين 100 ميكرولتر إلى 1 مل، 2 مل أو أكثر، اعتمادا على عندما تحتاج خلايا الخميرة لتكون حصاد اليوم التالي). القيام بهذه الخطوة لضمان أن واحدا من الثقافات هو في OD الصحيح ₆₀₀ في اليوم التالي.

2. حصاد خلايا الخميرة

1. الاستعداد لحصاد الخلايا الخميرة. توقيت هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية. تسمية كل الأنابيب المطلوبة وجمع جميع المعدات والمواد المطلوبة في مكان واحد. سخن حمام مائي إلى 39 درجة مئوية، وسخن اثنين من 15 مل أنابيب اختبار من وسائط النمو عند 28 ° C وعند 60 ° C.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف حجم 15 مل وسائل الاعلام النمو اعتمادا على عدد من النقاط الزمنية كانت الخلايا ليتم حصادها.
2. حصاد الخلايا الخميرة عندما توصل إلى OD ₆₀₀ من 0،4-0،7. Transfإيه الخلايا إلى 4 - 6 مل العقيمة 50 المسمار زجاجات الغطاء. أجهزة الطرد المركزي في 7،500 x ج في سرعة الطرد المركزي عالية لمدة 5 دقائق على RT.
3. تجاهل طاف و resuspend الكريات في وسائل الإعلام نمو 15 مل الذي توازنه عند 28 درجة مئوية. تجميع خلايا الخميرة في واحدة معقمة 250 مل قارورة وتتوازن لهم ل~ 5 دقائق في درجة حرارة النمو 28 درجة مئوية.
4. بعد أن معايرتها خلايا الخميرة في درجة حرارة النمو، إضافة على الفور 15 مل من وسائط النمو معايرتها في 60 ° C لرفع درجة الحرارة إلى 39 درجة مئوية (درجة حرارة nonpermissive) ووضع على الفور القارورة في 39 ° C حمام الماء . تأكد من أن مستنبت يبقى في 39 ° C حمام الماء طوال ما تبقى من خطوات حصاد الخلايا لضمان تشغيل تلك النسخ قبالة.
5. حصاد الخلايا في أوقات مختلفة بعد وضع القارورة في 39 ° C حمام الماء. لنقطة لأول مرة، حصاد الخلايا مباشرة بعد وضع القارورة في 39 & #176، C. حصاد قسامة 3 مل وتوزيع مل 3 إلى قسمين، 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. بيليه الخلايا لمدة 10 ثانية في جهاز للطرد المركزي مصغرة أو picofuge مع التباطؤ السريع واسكب طاف.
6. تجميد فورا بيليه في منطقة جافة حمام الثلج / الايثانول أو في النيتروجين السائل. تعيين نقطة لأول مرة يتم حصاد الخلايا في كنقطة الوقت الصفر.
7. تجريبيا تحديد نقاط زمنية يتم حصاد الخلايا في بعد ذلك عن طريق تجربة رائدة، وهذا يتوقف على من mRNAs من الفائدة. عادة، وخلايا الخميرة في حصاد النقاط الزمنية التالية: 0، 3، 6، 9، 12، 18، 25 و 35 دقيقة (الشكل 2B). إذا كان مرنا نصف الحياة لا يمكن تحديدها باستخدام النقاط الزمنية المذكورة أعلاه، وضبط هذه النقاط الوقت. على سبيل المثال، من mRNAs مع المتوقع حياة نصف قصيرة، استخدم أقصر الأوقات نقطة (أي، 0، 1، 2، 3، 4، 6، 9، 12 و 18 دقيقة) وللمن mRNAs مع المتوقعة نصف حياة طويلة، تمديد نقاط الوقت.
8. بعد الخلايا هي هكتارrvested، وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بها.

3. استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة

1. لRNA استخراج جزء من البروتوكول، واستخدام تقنيات ريبونوكلياز الحرة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي التي كتبها RNases. إعداد ريبونوكلياز الحلول المجانية، والأواني الزجاجية والأدوات البلاستيكية لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي.
2. استخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة وفقا لبروتوكولات القياسية. عادة، استخدام الأسلوب الفينول الساخن ^12. بدلا من ذلك، استخدام مجموعات التي يمكن استخدامها لاستخراج الحمض النووي الريبي من خلايا الخميرة.
3. تحديد كمية ونقاء من الحمض النووي الريبي، وعادة عن طريق قياس الامتصاصية في A ₂₆₀ و A ₂₈₀ من 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي من A _260. وبناء على التركيز، وتمييع RNA إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر DEPC باستخدام المياه المعالجة.
   ملاحظة: نسبة A ₂₆₀ / A ₂₈₀ يقدم معلومات عن رهو نقاء من الحمض النووي الريبي. على عينة الحمض النووي الريبي هو محض إذا كانت نسبة A ₂₆₀ / A ₂₈₀ هي 2.0 ± 0.1.

4. الشمالية تحليل لطخة

ملاحظة: استخدم البقع شمال لقياس مستويات مرنا والحصول على معلومات عن حجم النصوص. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم البقع الشمالية للكشف عن من mRNAs التي تنتج الأشكال الإسوية متعددة من نفس مرنا.

1. إعداد 1.0٪ هلام الاغاروز-الفورمالديهايد. تشغيل كميات متساوية من عينة الحمض النووي الريبي على هلام الفورمالديهايد الاغاروز من قبل الكهربائي وفقا لبروتوكولات القياسية ^12. تشغيل سلم RNA جنبا إلى جنب مع عينات الحمض النووي الريبي واستخدامها لتحديد أحجام RNA التي يتم الكشف عنها على لطخة الشمالية. قبل نقل RNA فصل على هلام الفورمالديهايد الاغاروز إلى الغشاء، وقطع الممر مع سلم RNA من هلام وتصور باستخدام بروميد إيثيديوم.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن أن تكون ملطخة هلام كله مع بروميد إيثيديوم قبل نقل الحمض النووي الريبي.
2. Aهاجروا عينات fter الحمض النووي الريبي لمسافة مناسبة على هلام، ونقل الحمض النووي الريبي لغشاء باستخدام تقنيات ريبونوكلياز الحرة. استخدام واحدة من عدة بروتوكولات المتاحة لنقل RNA إلى الأغشية ^12-13. لنقل الحمض النووي الريبي لغشاء، وقطع الغشاء إلى ما يقرب من نفس حجم هلام. نقل RNA وفقا لبروتوكولات القياسية ^12.
3. الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط RNA إلى غشاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية crosslinker باتباع إرشادات الشركة المصنعة. بدلا من ذلك، خبز الغشاء في فرن المنصوص إلى 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تخزين الغشاء في -20 ° C في كيس من البلاستيك لأجل غير مسمى حتى يتم تهجين لتحقيقات محددة.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تخزين غشاء الجافة في RT بين أوراق الترشيح.

5. هجن تحقيقات التكميلي إلى RNA الاهتمام إلى غشاء

ملاحظة: طريقة واحدة للكشف مرنا على الغشاء هو هجن ³² P تحقيقات الحمض النووي المسمى. تنبيه: Researchers العمل مع ³² P تحتاج إلى استخدام إجراءات وقائية لمنع التلوث. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية على استخدام المواد المشعة.

1. إعداد التحقيق DNA التي وصفها 25 - 50 نانوغرام من الحمض النووي ليتم تهجين لغشاء وفقا لبروتوكولات القياسية ^12. توليد جزء DNA بواسطة PCR أو بلازميد الهضم. تحديد نشاط معين لجنة التحقيق DNA عن طريق عد 1 ميكرولتر من التحقيق DNA radiolabelled بعد أن يتم إزالة النيوكليوتيدات الفردية ^12.
2. سخن عازلة prehybridization / التهجين في 42 درجة مئوية. استخدام ~ 10 مل من المخزن المؤقت prehybridization / التهجين لكل 100 سم ² للغشاء ^12.
3. هجن 1-5 × 10 ⁶ الاجتماع التحضيري للمؤتمر من التحقيق DNA رديولبلد لكل مل من العازلة التهجين إلى O غشاء / N في فرن التهجين للكشف عن مرنا من الفائدة ^12. تأكد من أنه خلال التهجين دوران الفرن التهجين هو في الاتجاه الذييسبب الغشاء بأكمله إلى أن يتعرض إلى حل التهجين، لضمان التهجين السليم.
4. يغسل الغشاء مرتين في RT لمدة 15 دقيقة مع 50 مل من 2X SSPE ومرة واحدة على 65 درجة مئوية مع 50 مل من 2X SSPE / 2٪ SDS لمدة 15 دقيقة ^12. التفاف الغشاء في غلاف بلاستيكي للتأكد من أنه لا تجف أو تلوث الشاشة الفوسفور.
5. باستخدام عداد جيجر، وتقدير كثافة النشاط الإشعاعي على الغشاء.
   ملاحظة: يضمن هذا التقدير أن يتعرض الغشاء إلى الشاشة الفوسفور لكمية مناسبة من الوقت. استخدام التعرض مرات أطول لأغشية مع كميات منخفضة من النشاط الإشعاعي.
6. لالبقع الشمالية، استخدم تحكم التحميل للتأكد من أن كميات متساوية من RNA يتم تحميلها على كل بقعة. للقيام بذلك، تجريد الغشاء وreprobe ذلك مع RNA التي لا تتأثر عملية يجري بحثها. تجريد الغشاء عن طريق وضعها في علبة زجاجية تحتوي على 200 مل من الغليان تجريد الحل (0.1٪ SDS / 0.01 XSSC) لمدة 2 دقيقة. من اجل الخروج من حل تجريد وكرر الإجراء خمس مرات ^(12).
   ملاحظة: مثال RNA تستخدم كعنصر تحكم التحميل هو SCR1 SCR1 هو نسخة RNA البلمرة III التي هي مستقرة وفرة يجب SCR1 فرة RNA لم تتغير بشكل ملحوظ خلال فترات قصيرة من RNA البلمرة II تثبيط.

6. قياس RNA المنضم إلى غشاء

ملاحظة: لقياس كمية النشاط الإشعاعي على الغشاء، وفضح الغشاء إلى شاشة الفوسفور. بعد وقت التعرض المناسب، مسح الشاشة باستخدام الفوسفور phosphorimager.

1. مسح الشاشة الفوسفور باستخدام الإرشادات المقدمة من قبل الشركة المصنعة للphosphorimager.
2. قياس مرنا في كل نقطة زمنية. تحديد مستويات مرنا باستخدام برنامج ImageQuant أو البرامج ذات الصلة. تطبيع مرنا في كل نقطة زمنية لرقابة التحميل. إذا تم استخدام SCR1 كما تحميلالسيطرة، وتطبيع northerns عمر النصف لSCR1.
3. يتم حساب عمر النصف للمرنا بقسمة كمية مرنا المتبقية في كل نقطة زمنية بمقدار مرنا الحاضر في وقت ونقطة 0 (نقطة زمنية الأولية). رسم بياني لمرنا في المئة المتبقية مقابل الوقت على قطعة semilogarithmic (الشكل 2C). حساب مرنا نصف العمر عن طريق المعادلة التالية:
   ر _1/2 = -0.693 / ك (سلبي 0،693)
4. ك هو المنحدر من أفضل خط مناسبا ور _1/2 هو مرنا نصف الحياة.

النتائج

قدرة هذا البروتوكول لقياس بدقة معدلات تسوس مرنا يعتمد على تثبيط النسخ، حصاد خلايا الخميرة في نقاط زمنية مناسبة، واستخدام تقنيات المجانية ريبونوكلياز أثناء استخراج RNA والنشاف الشمالي. التحقيق لمدة من mRNAs السيطرة المعروف أن تكون غير مستقرة ومستقرة، على التوالي، و?...

Discussion

تثبيط تخليق مرنا ومراقبة دوران مرنا في غياب توليفة جديدة هو الأسلوب الذي كثيرا ما يستخدم لقياس معدلات تسوس مرنا. في S. الخباز، وقياس معدلات تسوس مرنا عن طريق تثبيط النسخ باستخدام أليل حساس درجة حرارة RNA بوليميريز الثاني هو واحد من أكثر الوسائل استخداما. هذه الطري?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background