La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Resumen

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

los niveles de mRNA en estado estacionario varían dependiendo de las condiciones ambientales. La regulación de los niveles de acumulación estado estacionario de un ARNm asegura que la cantidad correcta de la proteína se sintetiza por las condiciones de crecimiento específicas de la célula. Un enfoque para medir las tasas de descomposición de ARNm es la inhibición de la transcripción y, posteriormente, el seguimiento de la desaparición de la ya presente mRNA. La tasa de descomposición de ARNm puede entonces ser cuantificada, y una vida media exacta se puede determinar utilizando varias técnicas. En S. cerevisiae, los protocolos que miden mRNA vidas medias han sido desarrollados e incluyen la inhibición de la transcripción de ARNm utilizando cepas que albergan un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1. Otras técnicas para la medición de mRNA media-vidas incluyen la inhibición de la transcripción con inhibidores transcripcionales tales como thiolutin o 1,10-fenantrolina, o alternativamente, mediante la utilización de mRNAs que están bajo el control de un promotor regulabletales como el promotor inducible de galactosa y el sistema TET-off. A continuación, describimos medición de S. las tasas de descomposición de ARNm cerevisiae utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Esta técnica se puede utilizar para medir las tasas de descomposición de ARNm de ARNm o de todo el genoma individuales.

Introducción

La transcripción y la descomposición de ARNm específicos son determinantes cruciales de la expresión génica. La tasa de síntesis y descomposición de ARNm específicos determina el nivel de estado estacionario de que el ARNm particular. Los niveles de estado estacionario de ARNm regulan la abundancia de ARNm y determinar la cantidad de cada mRNA está disponible para la síntesis de proteínas. Las mediciones de ARNm vidas medias se utilizan ampliamente para determinar la tasa de descomposición de ARNm. MRNAs decaimiento específico a diferentes tasas que están relacionados con las características del ARNm, la función de la proteína codificada por el ARNm y las condiciones ambientales. Dependiendo de la técnica utilizada para determinar las tasas de descomposición de ARNm, mediciones de la tasa de descomposición se pueden determinar de forma global o por transcripciones individuales. En la levadura S. cerevisiae, las técnicas que se usan más comúnmente para medir las tasas de descomposición de ARNm global incluyen la utilización de una cepa de levadura que alberga el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II y transc químicainhibidores de riptional tales como thiolutin y 1,10-fenantrolina ^1-5. Estos métodos también pueden ser utilizados para medir las tasas de descomposición de ARNm individuales ^4. Otros métodos pueden utilizarse también para medir las tasas de descomposición de ARNm. Estos métodos incluyen enfoque de etiquetado de estado estacionario o la utilización de moléculas de ARNm que se expresan a partir de un promotor regulado que se expresa sólo en ciertas condiciones. Cada una de estas técnicas tiene ciertas ventajas y limitaciones. La técnica descrita aquí utiliza el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Este método utiliza S. cerevisiae como el modelo, pero puede sido modificado y utilizado en otros sistemas que utilizan técnicas de inhibición de la transcripción específicos ^6.

mRNA mediciones de vida media utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II se utilizan ampliamente para ambas mediciones a escala del genoma e individuales de mRNA decadencia ^4-5. Esta técnica requiere el uso de un específic cepa de levadura que alberga un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1 ^1. El fundamento de esta técnica es que la exposición de la cepa de levadura sensible a la temperatura a la temperatura no permisiva inhibe la síntesis de mRNA. Posteriormente, el decaimiento del ARNm preexistente se controla en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha inhibido. La desaparición del mRNA preexistente se controla mediante la extracción de ARN a partir de las células de levadura en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha apagado. Los puntos de tiempo en el que se cosechan las células de levadura están predeterminados por un experimento piloto, y dependen de las transcripciones y sistema siendo investigados. Puntos de tiempo más rápidos se utilizan para transcripciones de corta duración, mientras que los puntos de tiempo más largos se utilizan para transcripciones de vida más larga. Después, el decaimiento del ARNm se controla por cualquiera de análisis de transferencia Northern, PCR cuantitativa o RNAseq.

La medición de mRNA vidas medias usando una temperatura alelo sensible de la ARN polimerasa II tiene sus ventajas. En primer lugar, esta técnica es fácil y sencillo. En segundo lugar, una vez que la cepa de levadura se adquiere o se genera en el laboratorio de las mediciones de la vida media de ARNm se pueden determinar en diferentes condiciones de crecimiento; para determinación de la influencia del medio ambiente en mRNA decadencia. En tercer lugar, las tasas de descomposición de ARNm pueden ser monitoreados en todo el genoma. El uso de otras técnicas de inhibición de la transcripción también tiene ventajas y limitaciones. Por ejemplo, el uso de un promotor inducible requiere subclonación para generar un ARNm que está bajo el control del promotor regulado. Thiolutin no está fácilmente disponible y es caro cuando esté disponible. Además, el modo de thiolutin de acción no se entiende completamente y se ha informado a afectar a otros procesos celulares, incluyendo la inhibición de descomposición de ARNm ^7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, es más fácilmente disponible. Además, todas las técnicas utilizadas para inhibir la transcripción puede perturb función celular y puede afectar a diferentes ARNm de maneras distintas. Un investigador debe determinar el método más apropiado para utilizar en sus condiciones experimentales para obtener los resultados más fiables. Para determinar qué método es el más adecuado para su aplicación, un investigador necesita identificar las transcripciones y función de las proteínas codificadas por las transcripciones que se investigan. Las mediciones de la tasa por mRNA decadencia más fiables son los que se determinó a través de múltiples técnicas y muestran la misma velocidad de desintegración. Ninguna técnica es siempre la mejor, y la técnica más apropiada depende de la situación específica.

Numerosos estudios en S. cerevisiae han medido las tasas de descomposición de ARNm en diferentes condiciones y las bases genéticas. Las condiciones que las tasas de descomposición de ARNm se miden en dependen del experimento específico siendo investigado. Medición de las tasas de descomposición de ARNm en diferentes entornos celulares determina si las condiciones de serexaminados afectar preferentemente las tasas de descomposición de ARNm específicos. Las tasas de descomposición de ARNm también puede variar dependiendo de la cepa de levadura que se utiliza. Por ejemplo, las tasas de descomposición de ARNm se pueden determinar en células de levadura de tipo salvaje y las células de levadura con una vía funcional degradación del ARNm tontería mediada (NMD). Esta vía de degradación de ARNm se encuentra en todos los organismos eucariotas que se han examinado hasta ahora y que provoca la degradación de los ARNm que terminan prematuramente traducción ^8. NMD se identificó inicialmente como una vía que degrada mRNAs con codones de terminación prematuros o codones sin sentido, pero ahora se reconoce como una vía que también regula la expresión de la no-absurdo que contiene mRNAs naturales. mRNAs que son objetivos de la vía se degradan rápidamente en células de levadura con una vía NMD funcional y se estabilizaron en células de levadura con una vía de NMD no funcional. Por lo tanto, la vida media de los ARNm que son blancos directos de esta vía son más cortos en levadura de tipo salvaje cells comparación con las células de levadura con una vía de NMD no funcional.

Protocolo

1. Crecimiento de células de levadura

1. Seleccionar las cepas de levadura adecuadas para ser utilizadas para las mediciones de tasa de descomposición de ARNm. Para inhibir la transcripción usando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, utilizar cepas de levadura que albergan la mutación rpb1-1 ^1. Obtener esta cepa de levadura de un laboratorio que ya tiene uno, o generar en el laboratorio usando técnicas convencionales si se requiere un fondo genético específico ^9.
2. Utilizando una técnica estéril, preparar los medios de levadura utilizando procedimientos estándar ^10. Si no se requiere la selección, preparación de medios ricos tales como YPD. Alternativamente, se preparan medios selectivos si se requiere las células de levadura se transforman con plásmidos y selección. Autoclave los medios de comunicación.
3. Cultivar las células de levadura a 28 ° C, que es la temperatura permisiva para esta cepa de levadura. Haced esto en dos pasos:
   1. Por primera O / N, crecen las células de levadura en 5 ml de medio de cultivo a la saturación.
   2. Configure la segunda O / N al final del segundo día. Para el segundo O / N, inocular diferentes cantidades de células de levadura de la primera O / N en 100 a 150 ml de medio de crecimiento (que van desde 100 l a 1 ml, 2 ml o más, dependiendo de cuando las células de levadura tienen que estar cosechado el día siguiente). Haga este paso para asegurarse de que una de las culturas es la correcta OD ₆₀₀ al día siguiente.

2. Recoger las células de levadura

1. Prepárese para cosechar las células de levadura. El momento para esta etapa es crítica; etiquetar todos los tubos necesarios y reunir todos los equipos y materiales necesarios en un solo lugar. Precaliente un baño de agua a 39 ° C y precalentar dos 15 ml tubos de ensayo de los medios de crecimiento a 28 ° C y 60 ° C.
   NOTA: El volumen de medio de 15 ml de crecimiento se puede variar en función del número de puntos de tiempo las células son para ser cosechado.
2. Recoger las células de levadura cuando llegan a una DO ₆₀₀ de 0,4 a 0,7. Transfer las células a 4 - 6 ml estériles tornillo 50 botellas de capitalización. Centrifugar a 7500 xg en una centrífuga de alta velocidad durante 5 min a RT.
3. Descartar el sobrenadante y volver a suspender las pastillas en los medios de cultivo de 15 ml que fue equilibrando a 28 ° C. Reunir las células de levadura en un matraz de 250 ml estéril y equilibrar ellos durante ~ 5 min a la temperatura de crecimiento de 28 ° C.
4. Después de que las células de levadura han equilibrado a la temperatura de crecimiento, añadir inmediatamente a los 15 ml de medio de crecimiento equilibrado a 60 ° C para elevar la temperatura a 39 ° C (la temperatura no permisiva) e inmediatamente colocar el matraz en el baño de agua 39 ° C . Asegúrese de que el medio de cultivo se mantiene en el 39 ° C baño de agua a través de los pasos de la recolección de células restantes para asegurarse de que la transcripción está apagado.
5. Recoger las células en diferentes momentos después de colocar el frasco en el 39 ° C baño de agua. Para el primer punto del tiempo, recoger las células inmediatamente después de colocar el matraz a 39 & #176; C. Cosecha de una alícuota de 3 ml y distribuir el 3 ml en dos, de 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Sedimentar las células durante 10 segundos en una mini centrífuga o picofuge con desaceleración rápida y vierte el sobrenadante.
6. Congelar inmediatamente el pellet en un baño de hielo seco / etanol o en nitrógeno líquido. Designar el primer punto de tiempo, las células se cosechan en como el punto de tiempo cero.
7. Experimentalmente determinar los puntos de tiempo las células se cosecharon a partir de entonces por un experimento piloto, en función de los mRNAs de interés. Normalmente, las células de la cosecha de la levadura en los siguientes puntos de tiempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 y 35 min (Figura 2B). Si la vida media de mRNA no puede ser determinada usando los puntos de tiempo mencionados anteriormente, ajustar estos puntos de tiempo. Por ejemplo, para los ARNm con vidas medias cortas previstos, usar tiempos más cortos de puntos, (es decir, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 y 18 min) y para los ARNm con largas vidas medias previstos, extender los puntos de tiempo.
8. Después las células se harvested, guárdelos en un congelador a -80ºC hasta la extracción de RNA se llevó a cabo.

3. Extraer el ARN de las células de levadura

1. Para la parte de extracción de RNA del protocolo, utilizar técnicas de RNasa libres para evitar la degradación del ARN por RNasas. Preparar RNasa soluciones gratuitas, cristalería y artículos de plástico que se utilizan en la extracción del ARN.
2. Extraer el ARN de las células de levadura de acuerdo con protocolos estándar. Normalmente, utilice el método de fenol caliente ^12. Alternativamente, utilizar kits que se pueden utilizar para extraer el ARN a partir de células de levadura.
3. Determinar la cantidad y pureza del ARN, normalmente mediante la medición de la absorbancia a A ₂₆₀ y A ₂₈₀ de 2 l de ARN usando un Nanodrop. Determinar la concentración del ARN a partir de la A _260. Sobre la base de la concentración, diluir el RNA a 1 g / l usando agua tratada con DEPC.
   NOTA: La relación de la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ proporciona información sobre tque la pureza del ARN. Una muestra de ARN es puro si la relación _A260 / _A280 es de 2,0 ± 0,1.

4. análisis de transferencia Northern

NOTA: Utilice transferencias Northern para cuantificar los niveles de ARNm y obtener información sobre el tamaño de las transcripciones. Además, utilice transferencias Northern para detectar ARNm que producen múltiples isoformas del mismo ARNm.

1. Preparar un gel de agarosa al 1,0%-formaldehído. Ejecutar cantidades iguales de la muestra de ARN en el gel de agarosa por electroforesis en formaldehído de acuerdo con protocolos estándar ^12. Ejecutar una escalera ARN junto con las muestras de ARN y lo utilizan para determinar los tamaños de los ARN que se detectan en el norte de mancha. Antes de transferir el ARN separados en el gel de agarosa formaldehído a una membrana, cortar el carril con la escalera de ARN a partir del gel y visualizar usando bromuro de etidio.
   NOTA: Como alternativa, todo el gel se puede teñir con bromuro de etidio antes de la transferencia del ARN.
2. Laespués de la muestras de ARN han migrado a una distancia apropiada en el gel, transferir el ARN a una membrana usando RNasa técnicas libres. Utilice uno de los varios protocolos disponibles para transferir ARN a membranas de ^12-13. Para transferir el ARN a una membrana, cortar la membrana a aproximadamente el mismo tamaño que el gel. Transferir el ARN de acuerdo con protocolos estándar ^12.
3. UV reticular el ARN a la membrana utilizando un agente de reticulación UV siguiendo las instrucciones del fabricante. Alternativamente, hornear la membrana en un horno a 80 ° C durante 1 hr. Almacenar la membrana a -20 ° C en una bolsa de plástico de forma indefinida hasta que se hibrida con sondas específicas.
   NOTA: La membrana seca también se puede almacenar a temperatura ambiente entre papeles de filtro.

5. hibridar sondas complementarias al ARN de interés para la Membrana

NOTA: Una forma de detectar ARNm en la membrana es para hibridar ³² P sondas de ADN marcadas. PRECAUCIÓN: Researchers trabajan con ³² P necesitan utilizar procedimientos de protección para evitar la contaminación. Siga las directrices institucionales sobre el uso de material radiactivo.

1. Preparar la sonda de ADN mediante el etiquetado de 25 - 50 ng del ADN que se hibrida con la membrana de acuerdo con protocolos estándar ^12. Generar el fragmento de ADN mediante PCR o digestión del plásmido. Determinar la actividad específica de la sonda de ADN contando 1 l de la sonda de ADN radiomarcada después de los nucleótidos no incorporados se eliminan ^12.
2. Tampón de prehibridación / hibridación Precalentar a 42 ° C. Utilice ~ 10 ml del tampón de prehibridación / hibridación por 100 cm ² de la membrana ^12.
3. Hibridan 1 - 5 x 10 ⁶ cpm de sonda de ADN radiomarcada por ml de tampón de hibridación a la membrana O / N en un horno de hibridación para detectar el ARNm de interés ^12. Asegúrese de que durante la hibridación de la rotación horno de hibridación es en una dirección quehace que toda la membrana al ser expuesto a la solución de hibridación, para asegurar la hibridación adecuada.
4. Lavar la membrana dos veces a temperatura ambiente durante 15 min con 50 ml de 2x SSPE y una vez en 65 ° C con 50 ml de 2x SSPE / SDS al 2% para 15 min ^12. Envuelva la membrana en plástico para asegurarse de que no se seque o contamine la pantalla de fósforo.
5. Usando un contador Geiger, estimar la intensidad de la radiactividad en la membrana.
   NOTA: Este cálculo se asegura de que la membrana se expone a la pantalla de fósforo por la cantidad apropiada de tiempo. Utilice tiempos de exposición más largos para las membranas con bajas cantidades de radiactividad.
6. Para el norte de blots, use un control de carga para confirmar que la misma cantidad de ARN se cargan en cada punto. Para ello, tira de la membrana y reprobe con un ARN que no es afectada por el proceso siendo examinado. Franja de la membrana mediante la colocación en una bandeja de vidrio que contiene 200 ml de ebullición de la solución decapante (0,1% SDS / 0,01 XSSC) durante 2 min. Vierta la solución de extracción y repita el procedimiento cinco veces ^12.
   NOTA:. Un ejemplo de un ARN utilizado como control de carga es SCR1 SCR1 es un transcrito de ARN polimerasa III que es estable y abundante SCR1 la abundancia de ARN no debería cambiar significativamente durante períodos cortos de RNA polimerasa II de inhibición..

6. Cuantificar el ARN que se une a la membrana

NOTA: Para cuantificar la cantidad de radiactividad en la membrana, exponer la membrana a una pantalla de fósforo. Después del tiempo de exposición adecuado, escanear la pantalla de fósforo mediante un fosforimager.

1. Busque en la pantalla de fósforo usando las instrucciones proporcionadas por el fabricante del fosforimager.
2. Cuantificar el ARNm en cada punto de tiempo. Cuantificar los niveles de ARNm utilizando ImageQuant software o software relacionado. Normalizar el mRNA en cada punto de tiempo para el control de carga. Si SCR1 fue utilizado como la cargacontrol, normalizar los norteños de vida media para SCR1.
3. La vida media del ARNm se calcula dividiendo la cantidad de ARNm restante en cada punto de tiempo por la cantidad de ARNm presente en el punto de tiempo 0 (el punto de tiempo inicial). Grafica la ARNm por ciento restante en función del tiempo en una parcela semilogarítmica (Figura 2C). Calcular mRNA vidas medias por la siguiente ecuación:
   t _1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693)
4. k es la pendiente de la línea de mejor ajuste y t _medio es la vida media de mRNA.

Resultados

La capacidad de este protocolo para medir con precisión las tasas de descomposición de ARNm depende de la inhibición de la transcripción, la recolección de células de levadura en los momentos adecuados, y la utilización de técnicas de RNasa libre mientras que la extracción de RNA y el norte de borrones. El sondeo de dos mRNAs de control conocidos a ser inestable y estable, respectivamente, proporciona la confianza de que el experimento funcionó. Por ejemplo, esto se puede lograr mediante sondeo con una s...

Discusión

La inhibición de la síntesis de mRNA y el seguimiento de rotación de ARNm en la ausencia de nueva síntesis es un método que se utiliza frecuentemente para medir las tasas de descomposición de ARNm. En S. cerevisiae, la medición de las tasas de descomposición de ARNm mediante la inhibición de la transcripción mediante el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II es uno de los métodos más frecuentemente utilizados. Este método inhibe específicamente la ARN polimerasa II. Los pasos más...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background