mRNAの崩壊料金の測定で<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em&gt;使い方<em&gt; rpb1-1</em&gt;株

要約

特定のmRNAの定常状態レベルは、mRNAの合成および減衰の速度によって決定される。ゲノムワイドなmRNAの分解速度または特定のmRNAの崩壊速度は、mRNAの半減期を決定することによって測定することができる。このプロトコルは、Saccharomyces cerevisiae中のmRNA減衰率の測定に焦点を当てています。

要約

mRNAの定常状態レベルは、環境条件に応じて変化する。 mRNAの定常状態の蓄積レベルの調節は、タンパク質の正確な量は、細胞の特定の増殖条件のために合成されることを保証する。 mRNA崩壊速度を測定するための一つのアプローチは、転写を阻害し、続いて、既に存在するmRNAの消失を監視している。 mRNA分解の速度を定量することができ、正確な半減期は、いくつかの技術を利用して決定することができる。 S.でセレビシエは 、mRNAの半減期を測定するためのプロトコルが開発され、RNAポリメラーゼII、rpb1-1の温度感受性対立遺伝子を保有する菌株を用いて、mRNAの転写を阻害することが含まれている。 mRNAの測定のための他の技術の半減期は、調節可能なプロモーターの制御下にあるmRNAを利用することにより、あるいはそのようなthiolutin又は1,10-フェナントロリンなどの転写阻害剤で転写を阻害する、または含むガラクトース誘導性プロモーター及びTETオフシステムとして。ここでは、Sの測定を説明RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用した出芽酵母のmRNA減衰率。この技術は、個々のmRNAまたはゲノムワイドのmRNA崩壊速度を測定するために使用することができる。

概要

特定のmRNAの転写および減衰は、遺伝子発現の重要な決定因子である。特定のmRNAの合成及び減衰率​​は、その特定のmRNAの定常状態レベルを決定する。 mRNAの定常状態レベルは、mRNAの豊かさを支配し、タンパク質合成のために提供されてどのくらいの各mRNAの決定する。 mRNAの半減期の測定は、mRNAの減衰率を決定するために広く使用されている。 mRNAは、mRNAおよび環境条件によってコードされるタンパク質の機能の特徴に関連して異なる速度で特定のmRNAの崩壊。 mRNA崩壊速度を決定するために利用された技術に応じて、減衰率の測定は、グローバルに、または個々の転写物について決定することができる。酵母S.でセレビシエ 、最も一般的にグローバルなmRNA崩壊速度を測定するために使用される技法は、RNAポリメラーゼII及び化学transcの温度感受性対立遺伝子を保有する酵母菌株を利用含まそのようなthiolutin 1,10-フェナントロリン^1-5としてriptional阻害^。これらの方法は、個々のmRNA崩壊率^4を測定するために利用することができる。他の方法もまた、mRNA崩壊速度を測定するために利用することができる。これらの方法は、定常状態の標識のみを選択条件において発現される調節されたプロモーターから発現されるmRNA分子の利用へのアプローチを含む。これらの技術は、それぞれ特定の利点と制限があります。ここに記載の技術は、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を利用する。この方法では、Sを使用してcerevisiaeのモデルとして、特定の転写阻害技法^6を用いて、他のシステムに変更され、利用されことができるが。

RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を用いたmRNAの半減期の測定は、広範囲のmRNA崩壊^4-5の両方のゲノム全体および個々の測定のために使用される。この技術は、specifの使用を必要とするRNAポリメラーゼII、rpb1-1 ¹の温度感受性対立遺伝子を保有するでIC酵母株。この技術の原理は、非許容温度に温度感受性酵母株の曝露は、mRNA合成を阻害することである。転写が阻害された後に続いて、既存のmRNAの崩壊は、様々な時点で監視される。既存のmRNAの消失は、転写がオフにされた後の異なる時点での酵母細胞からRNAを抽出することによって監視される。酵母細胞が収穫される時点は、パイロット実験により所定の、および研究されて転写物およびシステムに依存している。より長い時点長く生き転写物のために使用されている間より速い時点は、短命の転写物のために使用される。その後、mRNAの崩壊は、ノーザンブロット分析、定量的PCRまたはRNAseqいずれかによって監視される。

TEを使用して、mRNAの半減期の測定RNAポリメラーゼIIのmperature敏感な対立遺伝子は、その利点を持っています。第一に、この技術は、簡単で単純である。酵母株は、実験室で取得又は生成されると、第二の、mRNAの半減期の測定は、異なる成長条件で測定することができる。 mRNA分解の環境影響の決定を可能にする。第三に、mRNA崩壊速度は、ゲノム全体を監視することができる。他の転写抑制技術の使用は、利点および限界を有する。例えば、誘導性プロモーターの使用は、調節されたプロモーターの制御下にあるmRNAを生成するためにサブクローニングを必要とする。 Thiolutinは容易に入手できないと利用可能な場合に高価である。また、アクションのthiolutinのモードは完全には理解されず、mRNA崩壊^7の阻害^を含む他の細胞プロセスに影響を与えることが報告されている。また、1,10-フェナントロリンは、より容易に利用可能である。さらに、転写を阻害するために使用される技術の全ては、PERTでき細胞機能をURBと異なる方法で異なるmRNAに影響を与えることができる。研究者は、最も信頼性の高い結果を得るために彼らの実験条件で使用する最も適切な方法を決定する必要がある。彼らのアプリケーションに最も適している方法を決定するために、研究者が研究されている転写産物によりコードされるタンパク質の転写物および機能を特定する必要があります。最も信頼性の高いmRNA崩壊速度測定は、複数の技術を使用して決定し、同一の減衰速度を示しているものである。単一の技術は常に最善ではない、と最も適切な手法は、特定の状況に依存します。

S.で多数の研究セレビシエは、様々な条件や遺伝的背景においてmRNA崩壊速度を測定した。 mRNA崩壊速度がで測定されている条件が検討され、特定の実験に依存しています。異なる細胞環境におけるmRNA崩壊速度を測定する条件があるか否かを判断する優先的に特定のmRNAの崩壊率に影響を調べた。 mRNAの減衰率も使用されている酵母株に依存して変化し得る。例えば、mRNA崩壊速度は、非機能的ナンセンス変異依存mRNA分解（NMD）経路と、野生型酵母細胞、酵母細胞で測定することができる。このmRNA分解経路は、これまでに検討されている全ての真核生物に見られ、それは早期翻訳^8を終了し、mRNAの分解を誘発する。 NMDは当初早期終結コドンまたはナンセンスコドンとmRNAを分解する経路として同定されたが、今も自然なmRNAを含む非ナンセンスの発現を調節する経路として認識されている。経路の標的であるmRNAは急速に機能的なNMD経路を酵母細胞内で分解し、非機能的なNMD経路を酵母細胞中で安定化されている。したがって、この経路の直接の標的であるmRNAの半減期は、野生型酵母のセルが短い非機能的なNMD経路を有する酵母細胞と比較してのl​​s。

プロトコル

酵母細胞の1成長

1. mRNAの減衰率測定のために利用される適切な酵母株を選択する。 RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害するために、rpb1-1突然変異^1を保有する酵母株を使用しています。すでに1を持って研究室から、この酵母株を取得し、または特定の遺伝的背景が⁹必要な場合は、標準的な技術を用いて実験室でそれを生成する。
2. 無菌技術を使用して、標準的な手順^10を用いて酵母培地を準備。何も選択が必要とされない場合には、そのようなYPDなどのリッチメディアを準備します。酵母細胞をプラスミドで形質転換され、選択が必要な場合あるいは、選択培地を調製する。メディアオートクレーブ。
3. この酵母株を許容温度である28℃、で酵母細胞を成長させる。 2段階でこれを実行します。
   1. 最初のO / Nのために、飽和まで増殖培地5ml中の酵母細胞を成長させる。
   2. 二日目の終わりに第二のO / Nを設定します。第二のO / Nのために、第1のOから/ N（酵母細胞がする必要がある場合に応じて、100μlの1 mlの2ミリリットル以上までの範囲の増殖培地100〜150ミリリットル中に酵母細胞を異なる量の接種）次の日に収穫。文化の一つが正しいOD ₆₀₀で、次の日であることを保証するために、この手順を行います。

2.収穫酵母細胞

1. 酵母細胞を採取するために準備します。このステップのタイミングは非常に重要です。必要なすべてのチューブにラベルを付け、一箇所ですべての必要な機器や材料を集める。 39℃に水浴を予熱し、28℃、60℃、成長培地二つの15ミリリットル試験管を予熱する。
   NOTE：15ミリリットルの増殖培地の容積は、細胞が収穫される時点の数に応じて変化させることができる。
2. 彼らは0.7 OD 0.4の_600に達したときに、酵母細胞を収穫。 TRANSFER 4個の細胞 - 6無菌の50ミリリットルは、キャップボトルをねじ込みます。 RTで5分間の高速遠心機において7500×gで遠心する。
3. 上清を捨て、28℃で平衡化した15ミリリットルの増殖培地中のペレットを再懸濁します。 1滅菌250mlのフラスコに酵母細胞をプールし、28℃の成長温度で約5分間インキュベートして平衡化。
4. 酵母細胞は、成長温度で平衡化した後、直ちに39℃（非許容温度）の温度を上昇させるために60℃で平衡化した成長培地15mlのを追加し、直ちに39℃の水浴でフラスコを置き。培養培地は、その転写がオフになっていることを確認するために残りの細胞を収穫する段階を通じて39℃の水浴中で残っていることを確認します。
5. 39℃の水浴中にフラスコを置いた後、異なる時点で細胞を採取する。最初の時点では、39＆＃でフラスコを置いた直後に細胞を回収する176; C。 3ミリリットルアリコートを収穫し、2、1.5ミリリットルのマイクロチューブに3ミリリットルを配布。ミニ遠心機で10秒間細胞をペレットや急減速でpicofuge、上清を注ぐ。
6. 直ちにドライアイス/エタノール浴中で、または液体窒素中でペレットを凍結する。細胞を、ゼロ時点としてで収穫された最初の時点を指定する。
7. 実験的に関心のあるmRNAのに応じて、パイロット実験により細胞がその後に収穫された時点を決定する。通常は、以下の時点で収穫酵母細胞：0、3、6、9、12、18、25及び35分（ 図2B）。 mRNAの半減期は、上述した時点を用いて決定することができない場合は、これらの時点を調整する。例えば、予想される半減期の短いmRNAのために、短い時間のポイントを使用し、（ すなわち、0、1、2、3、4、6、9、12、18分）、および予想される長い半減期を有するmRNAのために、延長時間点。
8. 細胞の後ヘクタールであるRNA抽出が行われるまでrvestedは、-80℃の冷凍庫に保存する。

酵母細胞から3.抽出RNA

1. プロトコルのRNA抽出部は、RNaseによるRNAの分解を防ぐために、RNaseを含まない技術を使用する。 RNAの抽出に使用するRNaseを含まないソリューション、ガラス製品、プラスチックウェアを準備します。
2. 標準的なプロトコルに従って酵母細胞からRNAを抽出します。一般的に、ホットフェノール法^12を使用します。代替的に、酵母細胞からRNAを抽出するために使用することができるキットを使用。
3. 通常はナノドロップを用いたRNAの₂₆₀と₂₈₀ 2μlので吸光度を測定することにより、RNAの量および純度を決定します。濃度に基づいてA ₂₆₀からのRNAの濃度を測定、DEPC処理水を使用してを1μg/μlにRNAを希釈。
   NOTE：A _280分の260の比をtについての情報を提供RNAの彼は純度。 A ₂₆₀ / A ₂₈₀比は2.0±0.1である場合にRNAサンプルは純粋である。

4.ノーザンブロット分析

注：mRNAレベルを定量化し、転写産物のサイズに関する情報を取得するために、ノーザンブロットを使用してください。また、同じmRNAの複数のアイソフォームを生成するmRNAを検出するためのノーザンブロットを使用しています。

1. 1.0％アガロース - ホルムアルデヒドゲルを準備します。標準プロトコル¹²に従って電気泳動によりアガロースホルムアルデヒドゲル上のサンプルRNAの等量を実行します。 RNAサンプルと一緒にRNAラダーを実行し、ノーザンブロット上で検出されたRNAのサイズを決定するためにそれを使用。膜へのアガロースホルムアルデヒドゲル上で分離したRNAを転写する前に、ゲルからのRNAラダーとレーンを切断し、臭化エチジウムを用いて可視化する。
   注：また、全体のゲルはRNAの転写前、臭化エチジウムで染色することができる。
2. A押え上げRNA試料をRNaseを含まない技術を用いてメンブレンにトランスファーRNA、ゲル上の適切な距離まで移動する。メンブレン^12-13へのRNAを転送するために利用可能ないくつかのプロトコルのいずれかを使用してください。メンブレンにRNAを転写するために、ゲルとほぼ同じ大きさの膜を切断する。標準プロトコル¹²に従ってRNAを転送します。
3. UVを製造業者の説明書に従ってUVクロスリンカーを用いて膜にRNAをクロスリンクする。代替的に、1時間80℃でオーブン設定で膜を焼く。それは特定のプローブにハイブリダイズされるまで無期限にビニール袋に入れて-20℃で膜に保管してください。
   注：乾燥膜は、濾紙の間にRTで保存することができる。

5.ハイブリダイズするプローブメンブレンに興味のRNAに相補的な

注：膜上mRNAを検出する1つの方法は^、32 P標識DNAプローブをハイブリダイズすることである。注意：Resea³² Pでの作業rchersは汚染を防ぐために保護手順を使用する必要がある。放射性物質の使用に関する制度的なガイドラインに従ってください。

1. 25標識したDNAプローブを調製- DNA 50ngの標準的なプロトコル¹²に従って膜にハイブリダイズされる。 PCRまたはプラスミドの消化によりDNAフラグメントを生成する。取り込まれなかったヌクレオチドは^、12を除去した後に放射性標識したDNAプローブの1μLをカウントすることにより、DNAプローブの比活性を決定します。
2. 42℃で予熱プレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液。膜¹²を100 1cm ²当たりプレハイブリダイゼーション/ハイブリダイゼーション緩衝液の〜10ミリリットルを使用してください。
3. 関心¹²のmRNAを検出するためのハイブリダイゼーションオーブン内膜O / Nへのハイブリダイゼーション緩衝液1ml当たり放射性標識DNAプローブの5×10 ⁶ cpmの1 -ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの間に、ハイブリダイゼーションオーブン回転がその方向にあることを確認してください膜全体が適切なハイブリダイゼーションを確実にするために、ハイブリダイゼーション溶液に曝露させる。
4. 2×SSPE 50mlを15分間で¹²倍SSPE / 2％SDS、50 mlの65℃で1時間と室温で15分間、膜を2回洗浄する。それが完全に乾くまたは蛍光ス​​クリーンを汚染しないことを確実にするためにラップで膜を包みます。
5. ガイガーカウンターを用いて、膜上の放射能の強さを推定する。
   注：この推定値は、膜が適切な時間蛍光体スクリーンに曝露されることを保証する。放射能の低い量を有する膜のためのより長い露光時間を使用してください。
6. ノーザンブロットのために、等量のRNAが各スポットにロードされていることを確認するためにローディングコントロールを使用しています。これを行うには、膜を除去し、検査されているプロセスによって影響されないRNAでそれを再プローブ。 XS剥離液（0.1％SDS / 0.01を200mlの沸騰を含むガラストレイ内に配置することによって膜ストリップ2分間SC）。剥離液を注ぎ、手順5回^12を繰り返します。
   注：ローディングコントロールとして使用されるRNAの例は、SCR1 SCR1は安定しており、豊富なRNAポリメラーゼIII転写物ですSCR1 RNAの存在量は、RNAポリメラーゼII阻害の短い期間の間に大きく変化してはならない。。

6.膜に結合されたRNAを定量化

NOTE：蛍光スクリーンに膜をさらす、膜上の放射能の量を定量するために。適切な露光時間の後、ホスホイメージャを使用して蛍光面をスキャンします。

1. ホスホイメージャのメーカーが提供する指示を使用して蛍光面をスキャンします。
2. 各時点でmRNAを定量化する。をImageQuantソフトウェアまたは関連するソフトウェアを使用してmRNAレベルを定量化する。ローディングコントロールに各時点でmRNAを正規化する。 SCR1、ロードとして使用された場合コントロールは、SCR1に半減期のノーザンを正常化。
3. mRNAの半減期は、時刻0（初期時点）でのmRNAの存在量によって、各時点で残っているmRNAの量を割ることによって計算される。片対数プロット（ 図2C）に対時間残り％のmRNAをグラフ化。次の式でのmRNAの半減期を計算します。
   T _1/2 = -0.693 / K（負0.693）
4. kは、ベストフィット線の傾きであり、t _{1/2は、mRNA}の半減期である。

結果

RNAおよびノー​​ザンブロット法を抽出しながら、正確なmRNA減衰率を測定するために、このプロトコルの能力は、転写の阻害、適切な時点での酵母細胞の収穫、およびRNaseフリーの技術の利用に依存します。それぞれ、不安定で安定していることが知られている2つのコントロールのmRNAのためにプロービング、実験が働いていることを確信しています。例えば、これは、CYH2 mRNA前?...

ディスカッション

mRNA合成の阻害は、新しい合成の非存在下でのmRNAの代謝回転を監視するには、しばしばmRNA崩壊速度を測定するために使用される方法である。 S.でセレビシエは、RNAポリメラーゼIIの温度感受性対立遺伝子を使用して転写を阻害することによってmRNA崩壊率の測定は、最も頻繁に使用される方法の一つである。この方法は、具体的にはRNAポリメラーゼIIを阻害する。この技術を用い?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background