Mesure de la dégradation de l&#39;ARNm Tarifs en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilisation<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Les souches

Résumé

Le niveau de l'état d'équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l'ARNm. Taux de dégradation de l'ARNm pangénomiques ou les taux d'ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l'accent sur ​​la mesure du taux d'ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae.

Résumé

les niveaux de l'état d'équilibre ARNm varient en fonction des conditions environnementales. La régulation des niveaux d'accumulation de l'état d'équilibre de l'ARNm de sorte que la quantité correcte de protéine est synthétisée dans des conditions de croissance spécifiques de la cellule. Une approche pour mesurer ARNm taux de décroissance est l'inhibition de la transcription et de suivi suite à la disparition de l'ARNm déjà présent. Le taux de dégradation de l'ARNm peut alors être quantifiée, et une demi-vie précise peut être déterminée en utilisant plusieurs techniques. Dans S. cerevisiae, des protocoles permettant de mesurer la demi-vie de l'ARNm ont été développés et comprennent l'inhibition de la transcription de l'ARNm en utilisant des souches abritant un allele sensible de l'ARN polymerase II, de rpb1-1 température. D'autres techniques de mesure de demi-vie de l'ARNm comprennent des inhibiteurs de la transcription de la transcription tels que thiolutine ou 1,10-phénanthroline, ou en variante, en utilisant des inhibiteurs de ARNm qui sont sous le contrôle d'un promoteur régulabletel que le promoteur inductible par le galactose et le système TET-off. Ici, nous décrivons la mesure de S. taux de décroissance cerevisiae ARNm en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température. Cette technique peut être utilisée pour mesurer les taux d'ARNm des ARNm individuels ou l'ensemble du génome désintégration.

Introduction

La transcription et la décadence de l'ARNm spécifiques sont déterminants cruciaux de l'expression des gènes. Le taux de la synthèse et la décomposition des ARNm spécifiques détermine le niveau de cette ARNm particulier l'état d'équilibre. Les niveaux de l'état d'équilibre des ARNm régissent l'abondance d'ARNm et de déterminer combien de chaque ARNm est disponible pour la synthèse des protéines. Mesures de ARNm demi-vies sont largement utilisés pour déterminer le taux d'ARNm de décroissance. ARNm spécifique désintégration à des vitesses différentes qui sont liées aux caractéristiques de l'ARNm, la fonction de la protéine codée par l'ARNm et les conditions environnementales. Selon la technique utilisée pour déterminer les taux de NMD, les mesures de taux désintégration peuvent être déterminés soit globalement ou pour transcriptions des entretiens individuels. Dans la levure S. cerevisiae, les techniques les plus couramment utilisés pour mesurer les taux de NMD globale comprennent l'utilisation d'une souche de levure hébergeant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II et transc chimique températureinhibiteurs riptional tels que thiolutine et 1,10-phénanthroline ^1-5. Ces méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux de NMD individuelle ^4. D'autres méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux d'ARNm de désintégration. Ces méthodes comprennent approche de l'étiquetage de l'état d'équilibre ou de l'utilisation de molécules d'ARNm qui sont exprimés à partir d'un promoteur régulé qui est exprimé uniquement dans certaines conditions. Chacune de ces techniques a des avantages et des limites. La technique décrite ici utilise l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de la température. Cette méthode utilise S. cerevisiae comme modèle, mais peut être modifiée et utilisée dans d'autres systèmes utilisant des techniques d'inhibition de la transcription spécifiques ^6.

ARNm mesures demi-vie en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température sont largement utilisés pour les deux mesures de l'ensemble du génome et individuels de la dégradation des ARNm ^4-5. Cette technique nécessite l'utilisation d'un spécific souche de levure qui abrite un allèle sensible de l'ARN polymérase II, de rpb1-1 ^une température. La justification de cette technique est que l'exposition de la souche de levure sensible de la température à la température non permissive inhibe la synthèse de l'ARNm. Par la suite, la décomposition de l'ARNm pré-existante est contrôlée à différents points de temps après la transcription a été inhibée. La disparition de l'ARNm pré-existante est contrôlée par extraction de l'ARN à partir des cellules de levure à différents points dans le temps après la transcription a été coupé. Les points de temps au cours de laquelle les cellules de levure sont récoltées sont prédéterminés par une expérience pilote, et dépendent des transcriptions et le système à l'étude. Points de temps plus rapides sont utilisés pour les transcriptions de courte durée, tandis que les points de temps plus longues sont utilisées pour les transcriptions plus vécu. Par la suite, la décomposition de l'ARNm est contrôlée soit par analyse Northern blot, la PCR quantitative ou RNAseq.

Mesure de la demi-vie d'ARNm en utilisant un température allèle sensible de l'ARN polymérase II a ses avantages. Tout d'abord, cette technique est facile et simple. Deuxièmement, une fois la souche de levure est acquis ou généré en laboratoire les ARNm mesures demi-vie peuvent être déterminées dans différentes conditions de croissance; permettant de déterminer l'influence de l'environnement sur la dégradation de l'ARNm. Troisièmement, les taux d'ARNm de désintégration peuvent être surveillés échelle du génome. L'utilisation d'autres techniques d'inhibition de la transcription a aussi des avantages et des inconvénients. Par exemple, l'utilisation d'un promoteur inductible nécessite le sous-clonage pour générer un ARNm qui est sous le contrôle du promoteur régulé. Thiolutine ne est pas facilement disponible et est coûteux lorsqu'ils sont disponibles. En outre, le mode d'action de thiolutine ne est pas complètement comprise et il a été rapporté pour affecter d'autres processus cellulaires, y compris l'inhibition de la dégradation des ARNm ^7. Alternativement, la 1,10-phénanthroline, est plus facilement disponible. En outre, toutes les techniques utilisées pour inhiber la transcription peut perturb fonction cellulaire et peut affecter différents ARNm de façons distinctes. Un enquêteur doit déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser dans leurs conditions expérimentales pour obtenir des résultats les plus fiables. Pour déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour leur application, un chercheur doit identifier les transcriptions et la fonction des protéines codées par les transcriptions objet d'une enquête. Les mesures les plus fiables des taux d'ARNm de décroissance sont ceux qui sont déterminés en utilisant plusieurs techniques et de montrer le même taux de décroissance. Aucune technique ne est toujours la meilleure, et la technique la plus appropriée dépend de la situation spécifique.

De nombreuses études dans S. cerevisiae ont mesuré les taux de NMD dans diverses conditions et origines génétiques. Les conditions que les taux d'ARNm de désintégration sont mesurées en dépendent l'expérience spécifique à l'étude. Mesure ARNm taux de décomposition dans des environnements cellulaires différents détermine si les conditions étanta examiné préférentiellement affecter les taux d'ARNm spécifiques de désintégration. Les taux d'ARNm de désintégration peuvent également varier en fonction de la souche de levure utilisée. Par exemple, ARNm taux de décomposition peuvent être déterminées dans les cellules de levure de type sauvage et des cellules de levure avec une voie non fonctionnel dégradation de l'ARNm de nonsense-mediated (NMD). Cette voie de dégradation de l'ARNm se trouve dans tous les organismes eucaryotes qui ont été examinés à ce jour et il déclenche la dégradation des ARNm qui se terminent prématurément traduction ^8. NMD a été initialement identifiée comme une voie qui dégrade ARNm avec des codons de terminaison prématurés ou codons non-sens, mais est maintenant reconnue comme une voie qui réglemente également l'expression de non-nonsense contenant ARNm naturelles. ARNm qui sont des cibles de la voie sont rapidement dégradées dans les cellules de levure avec une voie de NMD fonctionnel et stabilisées dans des cellules de levure avec une voie de NMD non fonctionnel. Ainsi, les demi-vies d'ARNm qui sont des cibles directes de cette voie sont plus courts en levure de type sauvage cells rapport aux cellules de levure avec une voie NMD non fonctionnel.

Protocole

1. Croissance de cellules de levure

1. Sélectionner des souches de levure appropriées pour être utilisées pour les mesures de taux d'ARNm de la pourriture. Pour inhiber la transcription en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température, utiliser des souches de levure abritant la mutation rpb1-1 ^1. Obtenir cette souche de levure à partir d'un laboratoire qui a déjà une, ou le générer en laboratoire en utilisant des techniques standard si un contexte génétique spécifique est requise ^9.
2. Utilisant une technique stérile, préparer des milieux de levure utilisant des procédures standard ^10. Si aucune sélection ne est nécessaire, préparer des milieux riches tels que YPD. En variante, la préparation des milieux sélectifs si les cellules de levure sont transformées par des plasmides et la sélection est requise. Autoclave les médias.
3. Cultiver les cellules de levure à 28 ° C, qui est la température permissive pour cette souche de levure. Pour ce faire, en deux étapes:
   1. Pour la première O / N, croître les cellules de levure dans 5 ml de milieu de croissance à saturation.
   2. Mettre en place le deuxième O / N à la fin du deuxième jour. Pour la deuxième O / N, inoculer des quantités différentes de cellules de levure à partir de la première O / N dans 100 à 150 ml de milieu de croissance (allant de 100 ul à 1 ml, 2 ml ou plus, selon le moment où les cellules de levure doivent être récolté le jour suivant). Effectuez cette opération pour se assurer que l'une des cultures est à la bonne OD ₆₀₀ le lendemain.

2. récolter les cellules de levure

1. Préparation pour récolter les cellules de levure. Le calendrier de cette étape est critique; étiqueter tous les tubes nécessaires et de rassembler tout l'équipement et les matériaux requis en un seul endroit. Préchauffer un bain d'eau à 39 ° C et préchauffer 15 deux tubes à essai ml de milieu de croissance à 28 ° C et à 60 ° C.
   REMARQUE: Le volume de support 15 ml de la croissance peut varier en fonction du nombre de points dans le temps les cellules doivent être récoltées.
2. Récolter les cellules de levure lorsqu'ils atteignent une DO ₆₀₀ de 0,4 à 0,7. Transfer les cellules à 4 - 6 ml stériles 50 bouteilles à bouchon à vis. Centrifuger à 7500 xg dans une centrifugeuse à haute vitesse pendant 5 min à température ambiante.
3. Jeter le surnageant et remettre en suspension les boulettes dans les médias 15 ml de croissance qui a été équilibrage à 28 ° C. Regrouper les cellules de levure dans une fiole de 250 ml stérile et pour équilibrer les ~ 5 min à la température de croissance de 28 ° C.
4. Après que les cellules de levure avoir équilibré à la température de croissance, ajouter immédiatement les 15 ml du milieu de croissance équilibrée à 60 ° C pour élever la température à 39 ° C (la température non permissive) et placer immédiatement la fiole dans le bain d'eau à 39 ° . Assurez-vous que le milieu de culture reste dans le bain-marie de 39 ° tout au long des étapes restantes de récolte des cellules afin de se assurer que la transcription est éteint.
5. Récolter les cellules à différents moments après avoir placé le ballon dans le bain d'eau 39 C °. Pour le premier point de temps, récolter les cellules immédiatement après plaçant le ballon à 39 ans & #176; C. Récolter un 3 ml aliquote et distribuer le 3 ml en deux, 1,5 ml microtubes. Pellet les cellules pendant 10 secondes dans une mini centrifugeuse ou picofuge avec une décélération rapide et verser le surnageant.
6. Geler immédiatement le culot dans un bain de glace carbonique / éthanol ou dans l'azote liquide. Désignez le premier point, les cellules sont récoltées à comme point de temps zéro de temps.
7. Expérimentalement déterminer les points dans le temps, les cellules sont récoltées à la suite d'une expérience pilote, en fonction des ARNm d'intérêt. Normalement, les cellules de levure récolte aux points de temps suivants: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 et 35 min (figure 2B). Si la demi-vie de l'ARNm ne peut pas être déterminée en utilisant les points de temps mentionnées ci-dessus, ajuster ces points dans le temps. Par exemple, pour ARNm avec des demi-vies courtes prévues, utiliser plus courtes fois des points, (ce est à dire, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 et 18 min) et pour ARNm avec longues demi-vies prévues, prolonger les points de temps.
8. Après que les cellules sont harvested, rangez-les dans un congélateur à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ARN est réalisée.

3. Extraire l'ARN à partir des cellules de levure

1. Pour la partie d'extraction d'ARN du protocole, utilisez RNase techniques gratuits à prévenir la dégradation de l'ARN par RNases. Préparer RNase solutions libres, la verrerie et les articles en plastique à être utilisés dans l'extraction de l'ARN.
2. Extraire l'ARN à partir de cellules de levure selon des protocoles standards. Typiquement, utiliser la méthode de phénol chaud ^12. En variante, en utilisant des kits qui peuvent être utilisés pour extraire l'ARN à partir de cellules de levure.
3. Déterminer la quantité et la pureté de l'ARN, habituellement par mesure de l'absorbance à ₂₆₀ A et ₂₈₀ A de 2 ul d'ARN en utilisant une Nanodrop. Déterminer la concentration de l'ARN à partir de l'A _260. Sur la base de la concentration, diluer l'ARN à 1 ug / ul d'eau traitée au DEPC à l'aide.
   NOTE: Le rapport de la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ fournit des informations sur les til pureté de l'ARN. Un échantillon d'ARN est pur si le rapport A ₂₆₀ / A ₂₈₀ est de 2,0 ± 0,1.

4. Analyse Northern Blot

REMARQUE: Utilisez des transferts de Northern pour quantifier les niveaux d'ARNm et obtenir des informations sur la taille des transcriptions. En outre, utiliser des transferts de Northern pour détecter ARNm qui produisent des isoformes multiples de la même ARNm.

1. Préparation d'un gel d'agarose-formaldéhyde à 1,0%. Exécutez des quantités égales de l'ARN de l'échantillon sur le gel de formaldéhyde agarose par électrophorèse selon des protocoles standard ^12. Exécuter une échelle d'ARN à côté des échantillons d'ARN et l'utiliser pour déterminer la taille de l'ARN qui sont détectés sur le transfert de Northern. Avant de transférer l'ARN séparé sur gel d'agarose-formaldéhyde à une membrane, couper la voie à l'échelle de l'ARN à partir du gel et de visualiser en utilisant du bromure d'éthidium.
   NOTE: En variante, l'ensemble du gel peut être coloré avec du bromure d'éthidium avant le transfert de l'ARN.
2. Unéchantillons près la ARN ont migré vers une distance appropriée sur le gel, transférer l'ARN à une membrane en utilisant des techniques gratuits RNase. Utilisez l'une des plusieurs protocoles disponibles pour transférer ARN aux membranes ^12-13. Pour transférer l'ARN à une membrane, la membrane à couper à peu près la même taille que le gel. Transfert de l'ARN selon des protocoles standards ^12.
3. UV réticuler les ARN sur la membrane en utilisant un agent de réticulation aux UV suivant les instructions du fabricant. Sinon, faire cuire la membrane dans un four réglé à 80 ° C pendant 1 heure. Stocker la membrane à -20 ° C dans un sac plastique indéfiniment jusqu'à ce qu'elle soit hybridée à des sondes spécifiques.
   NOTE: La membrane sèche peut aussi être stockée à température ambiante entre papiers filtres.

5. hybrident sondes complémentaires à l'ARN d'intérêt à la membrane

REMARQUE: Un moyen de détecter l'ARNm de la membrane est d'hybrider des sondes d'ADN marquées de ³² p. ATTENTION: Researchers travaillant avec ³² P ont besoin d'utiliser des procédures de protection pour éviter la contamination. Suivez les directives institutionnelles sur l'utilisation de matières radioactives.

1. Préparation de la sonde d'ADN par marquage de 25 à 50 ng de l'ADN à hybrider à la membrane selon des protocoles standards ^12. Générer le fragment d'ADN par PCR ou digestion du plasmide. Déterminer l'activité spécifique de la sonde d'ADN en comptant 1 ul de la sonde d'ADN radiomarquée après les nucleotides non incorporés sont éliminés ^12.
2. Préchauffer le tampon de préhybridation / hybridation à 42 ° C. Utilisation ~ 10 ml du tampon de préhybridation / hybridation par 100 cm ² de la membrane ^12.
3. Hybrider 1-5 x 10 ⁶ cpm de sonde d'ADN radiomarquée par ml de tampon d'hybridation à la membrane O / N dans un four d'hybridation pour détecter l'ARNm d'intérêt ^12. Assurez-vous que lors de l'hybridation de la rotation du four est de l'hybridation dans une direction quiprovoque la totalité de la membrane à être exposée à la solution d'hybridation, pour assurer une hybridation appropriée.
4. Laver la membrane deux fois à température ambiante pendant 15 min avec 50 ml de SSPE 2x et une heure à 65 ° C avec 50 ml de SSPE 2x / 2% de SDS pendant 15 minutes ^12. Enveloppez la membrane dans une pellicule plastique pour se assurer qu'il ne se dessèche pas ou contaminer l'écran de phosphore.
5. L'utilisation d'un compteur Geiger, estimer l'intensité de la radioactivité sur la membrane.
   NOTE: Cette estimation se assure que la membrane est exposée à l'écran de phosphore pour le laps de temps approprié. Utilisez des temps plus longs d'exposition pour les membranes avec de faibles quantités de radioactivité.
6. Pour des transferts de Northern, utiliser un contrôle de chargement pour confirmer que des quantités égales d'ARN sont chargées sur chaque spot. Pour ce faire, enlever la membrane et reprobe avec un ARN qui ne est pas affectée par le processus en cours d'examen. Bande de la membrane en la plaçant dans un plateau en verre contenant 200 ml de solution d'extraction bouillante (0,1% SDS / 0,01 XSSC) pendant 2 min. Verser la solution de décapage et répétez la procédure cinq fois ^12.
   NOTE:. Un exemple d'un ARN utilisé comme témoin de chargement est SCR1 SCR1 est une transcription ARN polymérase III qui est stable et abondante SCR1 ARN abondance ne devrait pas changer de façon significative pendant de courtes périodes de l'ARN polymérase II d'inhibition..

6. Quantifier l'ARN qui est lié à la membrane

NOTE: Pour quantifier la quantité de radioactivité sur la membrane, la membrane exposer à un écran de phosphore. Après le temps d'exposition approprié, balayer l'écran de phosphore en utilisant un phosphorimager.

1. Balayez l'écran phosphore en suivant les instructions fournies par le fabricant de la phosphorimager.
2. Quantifier l'ARNm à chaque point de temps. Quantifier les niveaux d'ARNm en utilisant le logiciel ImageQuant ou logiciel associé. Normaliser l'ARNm à chaque point de contrôle de chargement de temps. Si SCR1 a été utilisé comme le chargementle contrôle, à normaliser les northerns demi-vie à SCR1.
3. La demi-vie de l'ARNm est calculé en divisant la quantité d'ARNm restant à chaque point de temps par la quantité d'ARNm présente au point de temps 0 (le point de temps initial). Graphiquement la ARNm pour cent restants en fonction du temps sur un terrain semi-logarithmique (figure 2C). Calculer la demi-vie d'ARNm par l'équation suivante:
   t _1/2 = -0,693 / k (négative 0,693)
4. k est la pente de la droite de meilleur ajustement et t _1/2 est la demi-vie de l'ARNm.

Résultats

La capacité de ce protocole pour mesurer avec précision ARNm taux de décroissance dépend de l'inhibition de la transcription, la récolte de cellules de levure au niveau des points de temps appropriés, et l'utilisation des techniques sans RNase lors de l'extraction de l'ARN et transfert de Northern. Palpage de deux ARNm de commande connus pour être instables et stables, respectivement, fournit l'assurance que l'expérience a fonctionné. Par exemple, ceci peut être accompli par sonda...

Discussion

L'inhibition de la synthèse de l'ARNm et de surveillance chiffre d'affaires de l'ARNm en l'absence de nouvelle synthèse est une méthode qui est fréquemment utilisé pour mesurer ARNm taux de décroissance. Dans S. cerevisiae, la mesure du taux de décroissance de l'ARNm en empêchant la transcription de l'allèle sensible à l'aide de l'ARN polymérase II de la température est une des méthodes les plus fréquemment utilisés. Ce procédé inhibe spécifiquement l'AR...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background