Misura di mRNA Decay Prezzi in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Utilizzo<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Ceppi

Riepilogo

Il livello di stato stazionario di specifici mRNA è determinata dalla velocità di sintesi e decadimento del mRNA. Velocità di degradazione mRNA genome-wide o dei tassi di decadimento di specifici mRNA può essere misurata determinando emivita mRNA. Questo protocollo si concentra sulla misurazione del mRNA tassi di decadimento in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

mRNA livelli allo steady variano a seconda delle condizioni ambientali. Regolamento delle costanti livelli di accumulo stato di un mRNA che assicura la corretta quantità di proteine ​​è sintetizzata per le condizioni di crescita specifici della cellula. Un approccio per misurare i tassi di decadimento mRNA è inibire la trascrizione e successivamente monitorare la scomparsa del già presente mRNA. La velocità di degradazione dell'mRNA può essere quantificato, e un accurato emivita può essere determinata utilizzando diverse tecniche. In S. cerevisiae, protocolli che misurano mRNA sono stati sviluppati emivita includono inibendo la trascrizione di mRNA utilizzando ceppi che ospitano un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1. Altre tecniche per mRNA emivite includono l'inibizione della trascrizione con inibitori trascrizionali come thiolutin o 1,10-fenantrolina, oppure misurando, utilizzando mRNA che sono sotto il controllo di un promotore regulatablecome il galattosio promotore inducibile e il sistema TET-off. Qui, descriviamo la misurazione di S. cerevisiae mRNA tassi di decadimento con l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II. Questa tecnica può essere usata per misurare mRNA tassi di decadimento di singoli mRNA o di tutto il genoma.

Introduzione

La trascrizione e il decadimento di mRNA specifici sono determinanti cruciali della espressione genica. La velocità di sintesi e decadimento di specifici mRNA determina il livello di stato stazionario di quel particolare mRNA. I livelli di stato stazionario di mRNA governano l'abbondanza di mRNA e di determinare quanto di ogni mRNA è disponibile per la sintesi proteica. Misure di emivita di mRNA sono ampiamente utilizzati per determinare il tasso di decadimento di mRNA. MRNA specifico decadimento a tassi diversi che sono legati alle caratteristiche del mRNA, la funzione della proteina codificata dal mRNA e delle condizioni ambientali. A seconda della tecnica utilizzata per determinare i tassi di decadimento mRNA, le misurazioni del tasso di decadimento possono essere determinati a livello globale o per i singoli trascrizioni. In lievito S. cerevisiae, le tecniche che sono più comunemente usati per misurare i tassi di decadimento mRNA globale includono utilizzando un ceppo di lievito ospitare l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II e transc chimicainibitori riptional come thiolutin e 1,10-fenantrolina ^1-5. Questi metodi possono anche essere utilizzati per misurare mRNA individuale decay rates ^4. Altri metodi possono anche essere utilizzati per misurare i tassi di decadimento mRNA. Questi metodi includono approccio alla etichettatura stato stazionario o l'utilizzo di molecole di mRNA che vengono espresse da un promotore regolamentato che si esprime solo in alcune condizioni. Ognuna di queste tecniche presenta alcuni vantaggi e limitazioni. La tecnica qui descritta utilizza l'allele termosensibile di RNA polimerasi II. Questo metodo utilizza S. cerevisiae come il modello, ma può modificato e utilizzato in altri sistemi utilizzando apposite tecniche di inibizione trascrizionale ^6.

mRNA misure emivita utilizzando l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II sono ampiamente utilizzati per entrambe le misure genome-wide e individuali di mRNA decadimento ^4-5. Questa tecnica richiede l'uso di un speciflievito ic che ospita un allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, rpb1-1 ^1. Il razionale di questa tecnica è che l'esposizione del ceppo di lievito termosensibile alla temperatura nonpermissive inibisce la sintesi di mRNA. Successivamente, il decadimento del mRNA preesistente viene monitorato in diversi momenti dopo la trascrizione è stato inibito. La scomparsa del mRNA preesistente è monitorato estraendo RNA dalle cellule di lievito a tempi diversi dopo la trascrizione è stata spenta. I punti di tempo in cui le cellule di lievito vengono raccolte sono predeterminati da un esperimento pilota, e dipendono dalle trascrizioni e il sistema in fase di studio. Punti di tempo più rapidi sono utilizzati per le trascrizioni di breve durata, mentre i punti di tempo più lunghi sono utilizzati per le trascrizioni lungo vissuto. Successivamente, il decadimento del mRNA è monitorato da una analisi Northern blot, PCR quantitativa o RNAseq.

Misura di emivita di mRNA utilizzando un temperature allele sensibile di RNA polimerasi II ha i suoi vantaggi. In primo luogo, questa tecnica è facile e semplice. In secondo luogo, una volta che il ceppo di lievito è acquisito o generato in laboratorio gli mRNA misure mezza vita possono essere determinati in diverse condizioni di crescita; consentire la ricostruzione della influenza ambientale sul mRNA decadimento. In terzo luogo, i tassi di decadimento mRNA possono essere monitorati a livello di genoma. L'utilizzo di altre tecniche di inibizione della trascrizione ha anche vantaggi e limiti. Ad esempio, l'uso di un promotore inducibile richiede subcloning per generare un mRNA che è sotto il controllo del promotore regolato. Thiolutin non è prontamente disponibile ed è costoso quando disponibile. Inoltre, la modalità di thiolutin di azione non è completamente noto ed è stato segnalato per influire su altri processi cellulari, tra cui l'inibizione mRNA decadimento ^7. In alternativa, 1,10-fenantrolina, è più facilmente disponibile. Inoltre, tutte le tecniche utilizzate per inibire la trascrizione può Perturb funzione cellulare e può colpire diversi mRNA in modi diversi. Un investigatore deve determinare il metodo più appropriato da utilizzare nelle loro condizioni sperimentali per ottenere i risultati più affidabili. Per determinare qual è il metodo più adatto per la loro applicazione, un ricercatore ha bisogno di identificare le trascrizioni e la funzione delle proteine ​​codificate dai trascrizioni di essere indagati. Le misurazioni dei tassi di mRNA decadimento più affidabili sono quelli che sono determinato usando diverse tecniche e mostrare lo stesso tasso di decadimento. Nessuna singola tecnica è sempre la migliore, e la tecnica più appropriata dipende dalla situazione specifica.

Numerosi studi in S. cerevisiae hanno misurato i tassi di decadimento mRNA in varie condizioni e background genetico. Le condizioni che i tassi di decadimento mRNA sono misurati in dipendono dalla esperimento specifico oggetto di indagine. Misurare i tassi di decadimento mRNA in differenti ambienti cellulari determina se le condizioni di essereesaminati preferenzialmente influenzare i tassi di decadimento di mRNA specifici. I tassi di decadimento di mRNA può anche variare a seconda del ceppo di lievito utilizzato. Ad esempio, i tassi di decadimento mRNA possono essere determinati in cellule di lievito wild-type e le cellule di lievito con un nonsense-mediata mRNA degradazione (NMD) percorso non funzionali. Questo degrado percorso mRNA si trova in tutti gli organismi eucarioti che sono stati esaminati finora e si innesca la degradazione di mRNA che terminano prematuramente traduzione ^8. NMD è stato inizialmente identificato come un percorso che degrada mRNA con codoni di terminazione prematuri o codoni nonsenso, ma è ormai riconosciuto come un percorso che regola anche l'espressione di non-nonsense contenente mRNA naturali. mRNA che sono gli obiettivi del percorso sono rapidamente degradati in cellule di lievito con un percorso NMD funzionale e stabilizzato in cellule di lievito con un percorso NMD non funzionale. Così, l'emivita di mRNA che sono obiettivi diretti di questa via sono più brevi in ​​wild-type lievito cells rispetto alle cellule di lievito con un percorso NMD non funzionali.

Protocollo

1. La crescita di cellule di lievito

1. Selezionare le opportune ceppi di lievito da utilizzare per le misure di mRNA tasso di decadimento. Per inibire la trascrizione con l'allele sensibile alla temperatura di RNA polimerasi II, utilizzare ceppi di lievito che ospitano la mutazione rpb1-1 ^1. Ottenere questo ceppo di lievito da un laboratorio che ha già uno, o generare in laboratorio utilizzando tecniche standard se un background genetico specifico è richiesto ^9.
2. Usando una tecnica sterile, preparare mezzi lievito utilizzando le procedure standard ^10. Se è necessaria alcuna selezione, preparazione rich media come YPD. In alternativa, preparare mezzi selettivi se è necessario le cellule di lievito vengono trasformate con plasmidi e selezione. Sterilizzare i media.
3. Crescere le cellule di lievito a 28 ° C, che è la temperatura permissiva per questo ceppo di lievito. Fate questo in due fasi:
   1. Per la prima O / N, crescere le cellule di lievito in 5 ml di terreni di crescita a saturazione.
   2. Impostare la seconda O / N alla fine del secondo giorno. Per il secondo O / N, inoculare diverse quantità di cellule di lievito dal primo O / N in 100 a 150 ml di mezzi di crescita (da 100 ml a 1 ml, 2 ml o più, a seconda di quando le cellule di lievito devono essere raccolti il ​​giorno successivo). Eseguire questo passaggio per assicurare che una delle culture è alla corretta OD ₆₀₀ il giorno seguente.

2. Raccogliere le cellule di lievito

1. Preparatevi a raccogliere le cellule di lievito. I tempi per questa fase è critica; etichettare tutti i tubi necessari e raccogliere tutte le attrezzature e materiali necessari in un unico luogo. Riscaldare a bagnomaria a 39 ° C e preriscaldare due 15 ml provette dei mezzi di crescita a 28 ° C ea 60 ° C.
   NOTA: Il volume del supporto 15 ml crescita può essere variato a seconda del numero di punti di tempo le cellule devono essere raccolte.
2. Raccogliere le cellule di lievito quando raggiungono un OD ₆₀₀ da 0,4 a 0.7. Trasfer le celle a 4-6 sterili 50 ml vite bottiglie tappo. Centrifugare a 7500 xg in una centrifuga ad alta velocità per 5 minuti a RT.
3. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in media di crescita di 15 ml che è stato equilibrante a 28 ° C. Pool le cellule di lievito in un pallone da 250 ml sterile e equilibrare per ~ 5 min alla temperatura di crescita 28 ° C.
4. Dopo che le cellule di lievito sono equilibrati alla temperatura di crescita, immediatamente aggiungere 15 ml di mezzi di crescita equilibrata a 60 ° C per aumentare la temperatura a 39 ° C (la temperatura nonpermissive) e collocare immediatamente il pallone nel bagno d'acqua a 39 ° . Assicurarsi che il terreno di coltura rimane nel bagno d'acqua 39 ° C durante le restanti fasi di raccolta delle cellule per garantire che la trascrizione è disattivata.
5. Raccogliere le cellule in diversi momenti dopo aver posizionato il pallone nel bagno di 39 ° C dell'acqua. Per la prima volta punto, raccogliere le cellule subito dopo aver posizionato il pallone a 39 & #176; C. Raccolto un'aliquota 3 ml e distribuire il 3 ml in due, 1,5 ml microprovette. Agglomerare le cellule per 10 secondi in un mini centrifuga o picofuge con decelerazione rapida e versare il surnatante.
6. Congelare immediatamente il pellet in un bagno di ghiaccio / etanolo secco o in azoto liquido. Designare il primo punto volta le cellule vengono raccolte presso il punto di tempo zero.
7. Sperimentalmente determinare i punti di tempo le cellule sono raccolte in seguito da un esperimento pilota, a seconda delle mRNA di interesse. Normalmente, le cellule di lievito raccolto ai seguenti punti di tempo: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 e 35 min (Figura 2B). Se l'emivita mRNA non può essere determinato utilizzando i punti di tempo di cui sopra, regolare questi punti di tempo. Ad esempio, per mRNA con emivita breve previsti, utilizzare tempi più brevi punti, (cioè, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 e 18 min) e mRNA con lunghe emivite previste, estendere i punti di tempo.
8. Dopo che le cellule sono ahrvested, li memorizza in un -80 ° C freezer fino a quando l'estrazione di RNA viene effettuata.

3. Estratto RNA dalle cellule di lievito

1. Per la parte di estrazione di RNA del protocollo, utilizzare RNase tecniche libere per evitare la degradazione dell'RNA da RNasi. Preparare RNase soluzioni gratuite, articoli in vetro e plastica ware per essere utilizzati nell'estrazione dell'RNA.
2. Estrarre il RNA dalle cellule di lievito secondo protocolli standard. In genere, utilizzare il metodo del fenolo a caldo ^12. In alternativa, utilizzare i kit che possono essere utilizzate per estrarre RNA da cellule di lievito.
3. Determinare la quantità e la purezza del RNA, normalmente misurando l'assorbanza a ₂₆₀ A e ₂₈₀ A di 2 ml di RNA utilizzando un Nanodrop. Determinare la concentrazione dell'RNA dalla A _260. Sulla base della concentrazione, diluire l'RNA a 1 mg / mL con acqua DEPC trattata.
   NOTA: Il rapporto tra la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ fornisce informazioni sulla tegli purezza del RNA. Un campione di RNA è pura se il rapporto A ₂₆₀ / A ₂₈₀ è di 2,0 ± 0,1.

4. Northern Blot Analysis

NOTA: Utilizzare macchie settentrionali per quantificare i livelli di mRNA e ottenere informazioni sulle dimensioni delle trascrizioni. Inoltre, utilizzare macchie nord per rilevare mRNA che producono molteplici isoforme dello stesso mRNA.

1. Preparare un gel di agarosio-formaldeide 1,0%. Eseguire la stessa quantità di RNA del campione sul gel di agarosio formaldeide mediante elettroforesi secondo protocolli standard ^12. Eseguire una scala di RNA a fianco dei campioni di RNA e utilizzarlo per determinare le dimensioni del RNA che vengono rilevati sulla macchia settentrionale. Prima di trasferire il RNA separati su gel di agarosio formaldeide ad una membrana, tagliare la sezione con la scaletta RNA dal gel e visualizzare con bromuro di etidio.
   NOTA: In alternativa, l'intero gel può essere colorato con bromuro di etidio prima del trasferimento del RNA.
2. Lacampioni opo l'RNA sono migrati ad una distanza appropriata sul gel, trasferire l'RNA di una membrana con RNase tecniche libere. Utilizzare uno dei diversi protocolli disponibili per il trasferimento RNA a membrane ^12-13. Per trasferire l'RNA ad una membrana, tagliare la membrana a circa la stessa dimensione del gel. Trasferire l'RNA secondo protocolli standard ^12.
3. UV cross-link del RNA alla membrana utilizzando un reticolante UV seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, la membrana cuocere in forno a 80 ° C per 1 ora. Conservare la membrana a -20 ° C in un sacchetto di plastica indefinitamente finché non viene ibridato a sonde specifiche.
   NOTA: La membrana secca può anche essere conservato a temperatura ambiente tra carte da filtro.

5. Ibridare sonde complementare al RNA di interesse per la membrana

NOTA: Un modo per rilevare mRNA sulla membrana è di ibridare ³² P sonde a DNA marcate. ATTENZIONE: Researchers lavorano con ³² P bisogno di utilizzare le procedure di protezione per prevenire la contaminazione. Seguire le linee guida istituzionali sull'uso di materiale radioattivo.

1. Preparare la sonda di DNA etichettando 25 - 50 ng del DNA da ibridati alla membrana secondo protocolli standard ^12. Generare il frammento di DNA mediante PCR o plasmide digestione. Determinare l'attività specifica della sonda DNA contando 1 microlitri della sonda di DNA marcata dopo i nucleotidi non incorporati vengono rimossi ^12.
2. Preriscaldare tampone prehybridization / ibridazione a 42 ° C. Utilizzare ~ 10 ml del tampone prehybridization / ibridazione per 100 cm ² della membrana ^12.
3. Ibridare: 1 - 5 x 10 ⁶ cpm di sonda di DNA radiomarcato per ml di tampone di ibridazione alla membrana O / N in un fornetto per rilevare l'mRNA di interesse ^12. Assicurarsi che durante l'ibridazione rotazione ibridazione forno è in una direzione cheprovoca tutta la membrana di essere esposti alla soluzione di ibridazione, per garantire la corretta ibridazione.
4. Lavare la membrana due volte a temperatura ambiente per 15 min con 50 ml di 2x SSPE e una volta a 65 ° C con 50 ml di 2x SSPE / 2% SDS per 15 min ^12. Avvolgere la membrana in involucro di plastica per assicurarsi che non si secchi o contaminare lo schermo Phosphor.
5. Utilizzando un contatore Geiger, stimare l'intensità della radioattività sulla membrana.
   NOTA: Questa stima assicura che la membrana è esposta alla schermata fosforoso per la quantità di tempo appropriato. Utilizzare tempi di esposizione più lunghi per le membrane con basse quantità di radioattività.
6. Per macchie settentrionali, utilizzare un controllo di carico per confermare che la stessa quantità di RNA vengono caricati su ogni punto. Per fare questo, striscia la membrana e reprobe con un RNA che non è influenzata dal processo in esame. Striscia la membrana ponendolo in un vassoio di vetro contenente 200 ml di soluzione bollente di stripping (0,1% SDS / 0,01 XSSC) per 2 min. Versare la soluzione stripping e ripetere la procedura per cinque volte ^12.
   NOTA:. Un esempio di RNA usato come controllo di caricamento è SCR1 SCR1 è un trascritto RNA polimerasi III che è stabile e abbondante SCR1 RNA abbondanza non dovrebbe cambiare significativamente durante brevi periodi di RNA polimerasi II inibizione..

6. Quantificare l'RNA che è legato alla membrana

NOTA: Per quantificare la quantità di radioattività su membrana, esporre la membrana ad uno schermo fosforoso. Dopo il tempo di esposizione del caso, la scansione della schermata Phosphor utilizzando un phosphorimager.

1. Scansione schermo Phosphor utilizzando le istruzioni fornite dal produttore del phosphorimager.
2. Quantificare l'mRNA in ogni punto. Quantificare i livelli di mRNA utilizzando il software ImageQuant o al software correlato. Normalizza l'mRNA ciascun tempo al controllo di carico. Se SCR1 è stato utilizzato come il caricamentoil controllo, normalizzare i northerns emivita di SCR1.
3. L'emivita del mRNA viene calcolata dividendo la quantità di mRNA rimanente in ciascun punto temporale dalla quantità di mRNA presenti al punto temporale 0 (il punto di tempo iniziale). Rappresentare graficamente la percentuale mRNA rimanente in funzione del tempo su un terreno semilogaritmica (Figura 2C). Calcolare emivite mRNA dalla seguente equazione:
   t _1/2 = -0,693 / k (negativo 0,693)
4. k è l'inclinazione della retta di regressione e t _1/2 è l'emivita mRNA.

Risultati

La capacità di questo protocollo per misurare con precisione i tassi di decadimento mRNA dipende l'inibizione della trascrizione, la raccolta di cellule di lievito nei momenti opportuni, e l'utilizzo di tecniche di RNasi libero, mentre l'estrazione dell'RNA e Northern blotting. Probing per due mRNA controllo notoriamente instabile e stabile, rispettivamente, prevede la fiducia che l'esperimento ha funzionato. Ad esempio, questo può essere realizzato attraverso una prova con una sonda che rile...

Discussione

L'inibizione della sintesi di mRNA e monitoraggio fatturato mRNA in assenza di nuova sintesi è un metodo che viene spesso utilizzato per misurare i tassi di decadimento mRNA. In S. cerevisiae, la misurazione dei tassi mRNA decadimento inibendo la trascrizione usando l'allele termosensibile di RNA polimerasi II è uno dei metodi più usati. Questo metodo inibisce specificamente l'RNA polimerasi II. Le fasi più critiche per la determinazione dei tassi di decadimento mRNA con questa tecnica sono: 1) ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background