MRNA Çürüme Oranlarının Ölçümü<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</emKullanma&gt;<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Suşlar

Özet

Belirli mRNA'ların sabit durum seviyesi mRNA sentezi ve çürüme oranı ile tespit edilir. Genom mRNA azalma oranları ve özel mRNA bozunma oranları mRNA'nın yarı ömürleri saptanmasıyla ölçülebilir. Bu protokol Saccharomyces cerevisiae mRNA bozunma oranlarının ölçümü üzerinde duruluyor.

Özet

mRNA kararlı durum düzeyleri çevresel koşullara bağlı olarak değişir. Bir mRNA'nın kararlı durum birikimi seviyelerinin düzenlenmesi proteinin doğru miktarı, hücrenin özel büyüme koşulları için sentez edilmesini sağlar. MRNA bozulma oranlarını ölçmek için bir yaklaşım transkripsiyonu inhibe ve daha sonra zaten mevcut mRNA kaybolması izleme olduğunu. mRNA azalma oranını daha sonra tayin edilebilir ve doğru bir yarı ömür çeşitli teknikler kullanılarak tespit edilebilir. S. cerevisiae yarı ömürleri geliştirilmiştir mRNA ölçmek ve RNA polimeraz II, rpb1-1 bir sıcaklığa duyarlı allel liman suşları kullanılarak mRNA'nın transkripsiyonunu inhibe içerir protokolleri. Bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında kodlayan mRNA kullanılarak yarı ömürleri gibi alternatif thiolutin veya 1,10-fenantrolin gibi veya kopyalama önleyicileri ile transkripsiyonu inhibe içerir mRNA ölçmek için diğer teknikler,Bu tür galaktoz ile uyarılabilir promoteri ve TET off sistemi. Burada, biz S. ölçümü tanımlamak RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile cerevisiae mRNA bozunma oranları. Bu teknik, tek tek mRNA ya da genom çapında mRNA bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir.

Giriş

transkripsiyon ve spesifik mRNA bozunma gen ekspresyonunun önemli belirleyicilerdir. sentez ve özel mRNA'ların çürüme oranı o mRNA kararlı durum seviyesini belirler. mRNA'lann kararlı durum düzeyleri mRNA bereket yöneten ve protein sentezi için ne kadar her mRNA belirler. MRNA yarı hayatımızın Ölçümler mRNA çürüme hızını belirlemek için yoğun olarak kullanılmaktadır. MRNA, mRNA ve çevre koşulları ile kodlanan proteinin fonksiyon özellikleri ile ilgili farklı oranlarda özel mRNA'lar bozunma. MRNA bozulma oranlarını belirlemek için kullanılan tekniğe bağlı olarak, çürüme hızı ölçümleri ya küresel ya da bireysel transkript için tespit edilebilir. Maya S. olarak cerevisiae, yaygın genel mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan teknikler, RNA polimeraz II ve kimyasal transkripsivonel sıcaklığa duyarlı allel barındıran bir maya suşu kullanılarak içerirBu tür thiolutin ve 1,10-fenantrolin ^1-5 gibi riptional inhibitörleri yer ^alır. Bu yöntemler ferdi mRNA bozunma hızını ⁴ ölçmek için kullanılabilir. Diğer yöntemler, ayrıca, mRNA'nın bozunma hızını ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemler, kararlı durum etiketleme veya yalnızca belirli koşullarda eksprese edilen bir düzenlenmiş arttırıcının eksprese edilen mRNA moleküllerinin kullanımına yolla uygulanabilir. Bu tekniklerin her biri belirli avantajlara ve sınırlamalar vardır. Burada anlatılan teknik, RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel kullanmaktadır. Bu yöntem, S. kullanır cerevisiae modeli olarak, spesifik transkripsiyon inhibisyon teknikleri ⁶ kullanan diğer sistemlerde değiştirilmiş ve kullanılmıştır ama.

RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile mRNA yarı ömrü ölçümleri kapsamlı mRNA bozulma ^4-5 iki genom ve tek tek ölçümler için kullanılmıştır. Bu teknik, bir Belir kullanımını gerektirirRNA polimeraz II, rpb1-1 ^{1 'in} bir sıcaklığa duyarlı allel barındırır ic maya suşu. Bu teknik için mantık infeksiyona izin vermeyen sıcaklık sıcaklığa duyarlı maya soyunun maruz mRNA sentezini inhibe olmasıdır. Transkripsiyon inhibe sonra Daha sonra, önceden mevcut olan mRNA çürüme farklı zaman noktalarında izlenir. önceden var olan mRNA kaybolması transkripsiyon kapatıldıktan sonra farklı zaman noktalarında, maya hücrelerinden RNA ekstre ederek izlenir. maya hücreleri hasat olduğu zaman noktaları pilot deney tarafından önceden belirlenmiş ve transkript ve sistem araştırılıyor bağlıdır edilmektedir. Daha uzun bir zaman noktaları uzun yaşayan transkript için kullanılır ise daha hızlı zaman noktalarında, kısa ömürlü transkript için kullanılır. Daha sonra, mRNA'nın çürüme ya da Kuzey benek analizi, kantitatif PCR ya da RNAseq ile izlenir.

Bir te kullanarak mRNA yarı ömürleri ÖlçümüRNA polimeraz II mperature duyarlı allel avantajları vardır. Öncelikle, bu teknik yalındır kolay ve. İkinci olarak, maya cinsi, mRNA, yarı ömrü ölçümleri değişik büyüme koşulları belirlenebilir laboratuarda elde edilen veya oluşturulan bir kez; mRNA çürüme çevre etkisinin belirlenmesi sağlayan. Üçüncü olarak, mRNA, bozunma oranları genom izlenebilir. Diğer transkripsiyon önleme tekniklerinin kullanımı da avantajları ve sınırlamaları vardır. Örneğin, bir uyarılabilir promoterin kullanılması düzenlenmiş bir arttırıcının kontrolü altında olan bir mRNA üretmek üzere subklonlama gerektirir. Thiolutin hazır değil ve zaman pahalı kullanılabilir. Ayrıca, eylem thiolutin en modu tam olarak anlaşılamamış ve mRNA çürüme ⁷ inhibe dahil olmak üzere diğer hücresel süreçleri etkilediği bildirilmiştir. Seçenek olarak ise, 1,10-fenantrolin, daha kolaylıkla temin edilebilir. Bundan başka, tüm teknikler pert olabilir transkripsiyonunu inhibe etmek için kullanılırHücresel fonksiyonu URB ve farklı şekillerde farklı mRNA'ları etkileyebilir. Bir araştırmacı, en güvenilir sonuçlar elde etmek için deneysel koşullarda kullanmak için en uygun yöntemi belirlemek gerekiyor. Uygulama için en uygun olan yöntem belirlemek için, bir araştırmacı araştırılmaktadır transkript tarafından kodlanan proteinlerin transkript ve işlevini tanımlamak gerekiyor. en güvenilir mRNA çürüme oranı ölçümleri birden teknikler kullanılarak ve aynı çürüme oranı gösteriyor belirlenir olanlardır. Tek bir tekniktir her zaman en iyi ve en uygun tekniği özel duruma bağlıdır.

S. sayısız çalışma cerevisiae çeşitli koşullarda ve genetik geçmişleri mRNA çürüme oranları ölçüldü. mRNA çürüme oranları ölçülür olduğu koşulların belirli deney araştırılıyor bağlıdır. Koşullar olmanın olsun farklı hücresel ortamlarda mRNA bozulma oranlarını Ölçme belirlertercihen özel mRNA bozulma oranlarını etkileyen incelenir. mRNA çürüme oranları da kullanılan maya suşu bağlı olarak değişebilir. Örneğin mRNA, bozunma oranları işlevsiz bir saçma kaynaklı mRNA azalma (NMD) yolu ile yabani tip maya hücreleri ve maya hücreleri belirlenebilir. Bu mRNA bozulması yolu şimdiye kadar incelenmiş tüm ökaryot organizmalarda bulunan ve erken çeviri ⁸ sonlandırmak mRNAların bozulmasını tetikler. NMD başlangıçta erken sonlandırma edilen ya da anlamsız kodonlanyla mRNA'ları düşürür bir yol olarak tespit edilmiştir, ama şimdi de doğal mRNA'ları içermeyen saçmalık ifadesini düzenleyen bir yol olarak kabul edilmektedir. yolunun hedefleri mRNA'lar hızla fonksiyonel NMD yolu ile maya hücrelerinde parçalanır ve fonksiyonel olmayan NMD yolu ile maya hücrelerinde stabilize edilir. Bu nedenle, bu yolağın doğrudan hedefleri olan mRNA yarı-ömürleri, yabani tip maya cel daha kısadır veBir fonksiyonel olmayan NMD yolu ile, maya hücreleri ile karşılaştırıldığında mi.

Protokol

Maya hücrelerinin 1. Büyüme

1. MRNA bozulma oranı ölçümleri için kullanılacak uygun maya suşları seçin. RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe etmek için, rpb1-1 mutasyon ¹ barındıran maya suşları kullanılır. Zaten var laboratuar bu maya suşu elde edilir, ya da belirli bir genetik arka ⁹ gerekli ise, standart teknikler kullanılarak laboratuarda üretecektir.
2. Standart prosedürler kullanılarak ¹⁰ maya ortamı hazırlamak, steril tekniği kullanarak. Hiçbir seçim gerekiyorsa, örneğin YPD gibi zengin medya hazırlamak. Plasmidler ve seçimi ile transforme edilmiş maya hücreleri gerekli ise, alternatif olarak, seçici ortam hazırlar. Medya otoklavlayın.
3. Bu maya suşu için müsamahakar sıcaklık 28 ° C'de maya hücreleri büyütün. İki adımda yapın:
   1. İlk olarak O / N için, doyma noktasına kadar büyüme ortamı 5 ml maya hücreleri büyür.
   2. İkinci günün sonunda ikinci O / N ayarlayın. Ikinci O / N, ilk olarak O / N, 100 ul 1 mi, 2 ml veya daha fazlasına kadar değişen büyüme ortamı (100-150 ml maya hücrelerinin farklı miktarlarda inoküle bağlı olarak maya hücreleri gerektiğinde ) ertesi gün toplandı. Kültürlerinden biri doğru OD ₆₀₀ Ertesi gün olmasını sağlamak için bu adımı yapın.

2. Hasat Maya Hücreleri

1. Maya hücreleri hasat hazırlayın. Bu aşama için zamanlama önemlidir; Gerekli tüm tüpleri etiket ve tek bir yerde tüm gerekli ekipman ve malzemeleri toplamak. 39 ° C bir su banyosu önceden ısıtmak ve C 28 ° C 'de ve 60 ° C'de büyüme ortamı içinde iki adet 15 ml'lik deney tüpleri ısıtın.
   NOT: 15 mi büyüme ortamı hacmi hücreleri hasat edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak değişebilir.
2. Onlar 0,7 bir OD 0.4 ₆₀₀ ulaştığınızda maya hücreleri Hasat. Transfer 4 hücreler - 50 6 steril ml kap şişe vida. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca yüksek hızlı santrifüj içinde 7500 x g'de santrifüjleyin.
3. Süpernatant atılır ve 28 ° C'de dengeye 15 mi büyüme ortamı içinde pelet tekrar süspansiyon. Bir steril 250 ml'lik bir şişe içinde maya hücreleri havuzda toplayın ve 28 ° C artış sıcaklıkta ~ 5 dakika boyunca, onları dengeye getirin.
4. Maya hücreleri büyüme sıcaklığında dengeye ulaştıktan hemen sonra, 39 ° C (infeksiyona izin vermeyen sıcaklık) kadar ısısını yükseltmek için 60 ° C 'de dengelenmiş bir büyüme ortamı 15 ml ilave edilir ve hemen 39 ° C su banyosu içine yerleştirilir . Kültür ortamı, transkripsiyon kapalı olduğundan emin olmak için, kalan hücre hasat etme aşamalarının boyunca 39 ° C su banyosu içinde kalmasını sağlayın.
5. 39 ° C su banyosu içinde bir balon yerleştirdikten sonra farklı zamanlarda hücreler hasat edilir. İlk kez noktası için, 39 & # de balon yerleştirdikten sonra hemen hücreler hasat176 ° C. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir 3 ml'lik bir şişe Hasat ve ikiye 3 ml dağıtın. Mini santrifüj içinde 10 saniye boyunca pelet hücreleri veya hızlı yavaşlama ile picofuge ve süpernatant dışarı dökün.
6. Hemen bir kuru buz / etanol banyosu içinde veya sıvı azot içinde dondurularak pelet. Hücreler sıfır zaman noktası olarak hasat ilk kez noktasını belirleyin.
7. Deneysel olarak ilgi mRNA bağlı olarak, bir pilot deneyi ile hücreler daha sonra hasat edilmiş zaman noktaları belirlenir. Normal olarak, aşağıdaki zaman noktalarında, hasat maya hücreleri: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 ve 35 dakika (Şekil 2B). MRNA yarılanma ömrü yukarıda belirtilen zaman noktalarını kullanarak tespit edilemiyorsa, bu sefer noktaları ayarlayın. Örneğin, beklenen kısa yarı ömürlü mRNA için, daha kısa süreler noktaları kullanarak (örneğin, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 ve 18 dakika) ve beklenen uzun yarı ömürleri olan mRNA için genişletmek zaman noktalarında.
8. Sonra hücreler, hektar olanRNA ekstraksiyon yapılır kadar rvested, -80 ° C derin dondurucuda saklayın.

Maya Hücreleri 3. Özü RNA

1. Protokol RNA ekstraksiyon kısmı için, RNaslar göre RNA bozulmasını önlemek için RNazsız tekniklerini kullanır. RNazsız çözümler, cam ve plastik eşya RNA ekstraksiyon kullanılacak hazırlayın.
2. , Standart protokollere göre, maya hücrelerinden RNA ekstrakte edin. Tipik haliyle, sıcak fenol metodu ¹² kullanımı. Seçenek olarak ise, maya hücrelerinden RNA çıkarmak için kullanılabilir setleri kullanın.
3. Normal olarak bir ₂₆₀ emicilik ve Nanodrop kullanılarak RNA'nın bir ₂₈₀ 2 ul ölçülerek, RNA miktarı ve saflık belirler. Konsantrasyonuna göre bir ₂₆₀ RNA konsantrasyonu belirlemek, 1 ug RNA seyreltik / DEPC işlenmiş su ile ul.
   NOT: Bir ₂₆₀ oranı / t hakkında bilgi sağlayan bir ₂₈₀RNA o saflık. A ₂₆₀ / A ₂₈₀ oranı 2.0 ± 0.1 ise bir RNA örneği saf.

4. Northern Blot analizi

NOT: mRNA düzeylerini ölçmek ve transkript boyutu hakkında bilgi almak için kuzeydeki lekeleri kullanın. Buna ek olarak, aynı mRNA'nın çok izoformlar üretmek mRNA'ların saptamak için northern blot kullanır.

1. % 1.0 agaroz-formaldehid jel hazırlayın. Standart protokollere göre ¹² elektroforez ile agaroz formaldehit jel üzerinde örnek RNA eşit miktarda çalıştırın. RNA örnekleri yanında bir RNA merdiveni çalıştırın ve kuzey leke tespit edilir RNA boyutlarını belirlemek için kullanabilirsiniz. Bir zar agaroz formaldehit jel üzerinde ayrılmış RNA aktarmadan önce, jel RNA merdiveni ile sokağın kesti ve etidyum bromür kullanarak görselleştirmek.
   NOT: Alternatif olarak, tüm jel RNA transferinden önce etidyum bromür ile boyanmış olabilir.
2. Birfter RNA numuneleri jel üzerinde uygun bir mesafede göç etti RNazsız teknikler kullanılarak bir zara RNA aktarın. Membranların ^12-13 kadar RNA aktarmak için kullanılabilecek birkaç protokollerden birini kullanın. Bir membrana transfer etmek için RNA, jel ile yaklaşık olarak aynı boyuta membran kesti. Standart protokollere göre ¹² RNA aktarın.
3. UV üreticisinin yönergeleri izleyerek UV çapraz bağlayıcı kullanılarak membran RNA çapraz bağlantı. Seçenek olarak ise, 1 saat boyunca 80 ° C'ye ayarlanmış bir fırın içinde membran fırında. Belirli problara hibridize edilir kadar belirsiz bir süre, bir plastik torba içinde -20 ° C de membran saklayın.
   NOT: Kuru zar da filtre kağıtları arasında oda sıcaklığında saklanabilir.

5. melezleşen Problar Membran İlgi RNA Tamamlayıcı

NOT: zar üzerinde mRNA'yı tespit etmek için bir yol ^32P olarak etiketlenmiş DNA sondaları hibridize etmektir. DİKKAT: Resea³² P ile çalışan rchers kontaminasyonu önlemek için koruyucu prosedürleri kullanmak gerekir. Radyoaktif madde kullanımı ile ilgili kurumsal kurallara uyun.

1. 25 etiketleme DNA probu hazırlayın - DNA 50 ng standart protokollere göre ¹² zara hibridize edilecek. PCR ya da plazmid sindirme ile DNA fragmanını üretir. Adi nükleotidleri ¹² çıkarıldıktan sonra radyo-etiketli DNA probu 1 ul sayılarak DNA probu spesifik aktivitesini belirler.
2. 42 ° C'de ön ısıtma ön hibridizasyon / hibridizasyon tamponu. Membran ^12, 100 ^cm2 başına ön hibridizasyon / hibritleme tampon maddesi ile 10 mL kullanın.
3. 1 melezleşme - membran O hibridizasyon tampon ml'si başına, radyo-etiketli bir DNA probu, 5 x 10 ⁶ cpm /, bir hibridizasyon etüvü içinde bir N ilgi ¹² mRNA'yı tespit etmek için. Melezleme sırasında hibridizasyon fırın dönme bir yönde olduğundan emin olun kitüm membran uygun hibridizasyon sağlamak için, hibridizasyon çözeltisine maruz neden olur.
4. 2x SSPE, 50 ml ve 15 dakika ¹² 2x SSPE /% 2 SDS, 50 ml 65 ° C de bir kez 15 dakika için oda sıcaklığında, membran iki kez yıkayın. O kurumasına veya Fosfor ekranı kontamine olmadığından emin olmak için plastik wrap membran sarın.
5. Bir Geiger sayacı kullanarak, membran üzerindeki radyoaktivite yoğunluğunu tahmin ediyoruz.
   NOT: Bu tahmin membran zaman uygun miktarda fosfor ekranına maruz kalmasını sağlar. Radyoaktivite düşük miktarlarda zarlar daha uzun maruz bırakma sürelerinin kullanılması.
6. Kuzey lekeleri için, RNA eşit miktarlarda her yerinde yüklenen onaylamak için bir yükleme denetimi kullanın. Bunu yapmak için, membran şerit ve işlem incelenen etkilenmez bir RNA ile yeniden taranması. XS sökme çözeltisi (% 0.1 SDS / 0.01 kaynayan 200 ml ihtiva eden bir cam tepsi üzerine yerleştirerek, membran şerit2 dakika boyunca SC). Sıyırma çözüm dökün ve prosedür beş kez tekrarlayın ^12.
   NOT:. Bir yükleme kontrolü olarak kullanılan bir RNA örneği SCR1 olan SCR1 istikrarlı ve bol bir RNA polimeraz III transkript olan SCR1 RNA bereket RNA polimeraz II inhibisyonu kısa dönemlerde önemli bir değişiklik olmamalıdır..

6. Membran Bound olan RNA niceliğini

NOT: zar üzerindeki radyoaktivite miktarını ölçmek bir fosfor ekranına membran göstermek için. Uygun pozlama süresinden sonra, bir fosforimager kullanılarak Fosfor ekranını tarayın.

1. Phosphorimager üreticisi tarafından sağlanan talimatları kullanarak Fosfor ekranını tarayın.
2. Her bir zaman noktasında mRNA ölçmek. ImageQuant yazılım veya ilgili yazılım kullanarak mRNA düzeylerini ölçmek. Yükleme kontrolü için her bir zaman noktasında mRNA normalize edilir. SCR1 yükleme olarak kullanılmışsaKontrol, SCR1 için yarılanma ömrü Northerns normalleştirmek.
3. mRNA bir yarılanma ömrü alanına 0 mRNA mevcut miktarıyla her zaman noktasında kalan mRNA miktarını (ilk zaman noktası) bölünmesi ile hesaplanır. Semilogaritmik arsa (Şekil 2C) üzerine, zamana karşı olarak kalan mRNA grafik. Aşağıdaki denklem ile mRNA yarı ömürleri hesaplayın:
   t _1/2 = -0,693 / k (negatif 0.693)
4. k en uygun doğrunun eğimi ve t _1/2 mRNA yarı-ömrü.

Sonuçlar

RNA ve kuzey blotting ayıklanması sırasında doğru mRNA bozulma oranlarını ölçmek için bu protokolün yeteneği RNazsız tekniklerin transkripsiyonu inhibe, uygun zaman noktalarında maya hücreleri hasat ve kullanımına bağlıdır. Sırasıyla, stabil olmayan ve kararlı olduğu bilinmektedir iki kontrol mRNA araştırmayı deney çalışan güven sağlar. Örneğin, bu ve mRNA ön CYH2 iki tespit eden bir prob ile tarama gerçekleştirilebilir oluşturulmaktadır. Şekil 2B, ...

Tartışmalar

MRNA sentezinin ve yeni sentez yokluğunda mRNA değişmesi takip durdurulması sıklıkla mRNA bozulma oranını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. S. cerevisiae RNA polimeraz II, sıcaklığa duyarlı allel ile transkripsiyonunu inhibe mRNA bozunma oranları ölçümü en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yöntem, özellikle, RNA polimeraz II inhibe eder. Bu tekniği kullanarak, mRNA bozulma oranlarının belirlenmesi için en kritik adımlar şunlardır: 1) maya hücreleri hasat önce, bu tr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background