Die Messung der mRNA-Abbau Preise in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Verwenden<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Die Stämme

Zusammenfassung

Die Steady-State-Level spezifischer mRNAs wird durch die Geschwindigkeit der Synthese und der Zerfall der mRNA bestimmt. Genomweite mRNA Abbauraten oder die Zerfallsraten spezifischer mRNAs kann durch Bestimmung mRNA Halbwertszeiten gemessen werden. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Messung der mRNA-Zerfallsraten in Saccharomyces cerevisiae.

Zusammenfassung

mRNA stationären Ebenen je nach Umgebungsbedingungen abhängig. Regulierung der stationären Aufstau einer mRNA stellt sicher, dass die korrekte Menge an Protein für die Zelle spezifische Wachstumsbedingungen synthetisiert. Ein Ansatz zum Messen der mRNA Zerfallsraten ist die Hemmung der Transkription und in der Folge der Überwachung des Verschwindens des bereits vorhandenen mRNA. Die Rate der mRNA-Zerfall kann dann quantifiziert werden, und eine genaue Halbwertszeit bestimmt werden kann unter Verwendung verschiedener Techniken. In S. cerevisiae, Protokolle, die mRNA Halbwertszeiten wurden entwickelt, messen und zählen Hemmung der Transkription der mRNA unter Verwendung von Stämmen, die ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 Hafen. Andere Techniken zum Messen mRNA-Halbwertszeiten umfassen Hemmung der Transkription mit Transkriptionsinhibitoren wie thiolutin oder 1,10-Phenanthrolin, oder alternativ durch Verwendung von mRNAs, die unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotorswie die Galactose induzierbaren Promotor und dem TET-off-System. Hier haben wir Messung S. beschreiben cerevisiae mRNA Zerfallsraten mit Hilfe der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Diese Technik kann verwendet werden, um mRNA-Zerfallsraten einzelner mRNAs oder genomweiten messen.

Einleitung

Die Transkription und Zerfall von spezifischen mRNA sind entscheidende Parameter der Genexpression. Die Rate der Synthese und Zerfall von spezifischen mRNAs bestimmt die Steady-State-Ebene des jeweiligen mRNA. Die stationären Mengen an mRNAs regeln die Fülle von mRNAs und bestimmen, wie viel von jeder mRNA zur Proteinsynthese zur Verfügung steht. Messungen der mRNA Halbwertszeiten werden in großem Umfang verwendet, um die Zerfallsrate von mRNAs zu bestimmen. Spezifische mRNAs Zerfall mit unterschiedlichen Raten, die sich auf Merkmale der mRNA, die die Funktion des Proteins von der mRNA und den Umgebungsbedingungen codiert verwandt sind. Abhängig vom verwendeten mRNA Zerfallsraten bestimmen Technik kann Abklingrate Messungen bestimmt werden entweder global oder für einzelne Transkripte. In der Hefe S. cerevisiae, die Techniken, die am häufigsten verwendet werden, um globale mRNA Zerfallsraten zu messen, umfassen die Verwendung eines Hefe-Stamm, der die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II und chemische Funkgeräteriptional Inhibitoren wie thiolutin und ^{1,10-Phenanthrolin-1-5.} Diese Methoden können auch verwendet werden, um einzelne mRNA Abklingraten ⁴ messen. Andere Verfahren können auch verwendet werden, um mRNA Zerfallsraten zu messen. Diese Methoden umfassen Ansatz zur stationären Kennzeichnung oder Verwendung von mRNA-Molekülen, die von einem regulierten Promotor, die für ausgewählte Bedingungen exprimiert wird, exprimiert werden. Jede dieser Techniken hat bestimmte Vor- und Nachteile. Die hier beschriebene Technik verwendet die temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II. Dieses Verfahren verwendet S. cerevisiae als Modell, kann aber unter Verwendung spezifischer Transkriptionshemmung Techniken ⁶ geändert und in anderen Systemen genutzt werden.

mRNA-Halbwertszeit-Messungen unter Verwendung des temperaturempfindlichen Allel von RNA-Polymerase II werden ausgiebig sowohl für genomweiten und individuellen Messungen der mRNA-Zerfall ^4-5 verwendet. Diese Technik erfordert die Verwendung einer spezific Hefestamm, der ein temperaturempfindliches Allel von RNA-Polymerase II, rpb1-1 ¹ beherbergt. Der Grund für dieses Verfahren ist, dass die Exposition der temperaturempfindlichen Hefestamm auf die nicht-permissive Temperatur hemmt mRNA-Synthese. Anschließend wird Verfall der bereits vorhandenen mRNA zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht nach der Transkription wurde inhibiert. Das Verschwinden von dem vorher existierenden mRNA wird durch Extrahieren von RNA aus den Hefezellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transkription abgeschaltet wurde überwacht. Die Zeitpunkte, an denen die Hefezellen geerntet werden von einem Pilotversuch vorbestimmten, und hängen von der Transkripte und untersuchten System. Schnellere Zeitpunkte werden für kurzlebige Transkripte verwendet, während längere Zeit Punkte werden für länger gelebt Transkripte verwendet. Danach wird der Zerfall der mRNA entweder durch Northern Blot-Analyse, quantitative PCR oder RNAseq überwacht.

Die Messung der mRNA Halbwertszeiten mit einem temperature empfindliche Allel von RNA-Polymerase II hat seine Vorteile. Erstens ist dieses Verfahren einfach und geradlinig. Zweitens, wenn der Hefestamm erfasst oder im Labor die mRNA-Halbwertszeit-Messungen in unterschiedlichen Wachstumsbedingungen bestimmt werden, erzeugt werden; ermöglicht die Bestimmung von Umwelt Einfluss auf mRNA-Zerfall. Drittens kann mRNA Zerfallsraten überwacht werden genomweite. Die Verwendung anderer Transkriptionshemmung Techniken hat auch Vorteile und Grenzen. Zum Beispiel kann die Verwendung eines induzierbaren Promotors erfordert Subklonierung zu einer mRNA, die unter der Kontrolle der regulierten Promotor zu erzeugen. Thiolutin ist nicht leicht erhältlich und teuer ist, wenn verfügbar. Zusätzlich wird Wirkungs thiolutin die nicht vollständig verstanden, und es wurde berichtet, dass andere zelluläre Prozesse, einschließlich Hemmung der mRNA-Zerfall ⁷ beeinflussen. Alternativ, 1,10-Phenanthrolin, ist leicht verfügbar. Ferner sind alle der Techniken verwendet werden, um Transkription zu hemmen, kann perturb Zellfunktion und kann verschiedene mRNAs in unterschiedlichen Weisen beeinflussen. Ein Ermittler muss die am besten geeignete Methode, um in ihren experimentellen Bedingungen nutzen, um die zuverlässigsten Ergebnisse erreichen zu bestimmen. Zu bestimmen, welche am besten geeignete Verfahren für ihre Anwendung ist, muss ein Forscher, die Transkripte und die Funktion der Proteine, die von den Transkripten kodiert suchten identifizieren. Die zuverlässigsten mRNA-Zerfall Leistungsmessungen sind diejenigen, die verwenden, bestimmt mehrere Techniken und zeigen dieselbe Abbaurate. Keine dieser Techniken ist immer die beste, und die am besten geeignete Technik, hängt von der speziellen Situation.

Zahlreiche Studien in S. cerevisiae haben mRNA Zerfallsraten in verschiedenen Bedingungen und genetischen Hintergründen gemessen. Die Bedingungen, die mRNA-Zerfall Preise sind in Mess hängen von der spezifischen Experiment untersucht. Mess mRNA Zerfallsraten in verschiedenen zellulären Umgebungen bestimmt, ob die Bedingungen, dasssuchten bevorzugt Einfluss auf die Zerfallsraten spezifischer mRNAs. Die Dämpfungsraten von mRNAs kann auch in Abhängigkeit von den Hefestamm je benutzt. Beispielsweise kann mRNA Zerfallsraten in Wildtyp-Hefezellen und Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) Weg bestimmt werden. Diese mRNA Abbauweg in allen eukaryontischen Organismen, die bisher untersucht wurden, gefunden, und es den Abbau von mRNAs, die vorzeitig zu beenden Übersetzung ⁸ auslöst. NMD wurde ursprünglich als ein Weg, der mRNAs mit vorzeitigen Stoppcodons oder Nonsense-Codons abbaut identifiziert, aber wird jetzt als ein Weg, der auch die Expression von nicht-Unsinn mit natürlichen mRNAs anerkannt. mRNAs, die als Ziele der Bahn sind, werden rasch in Hefezellen, die mit einem funktionellen NMD Weg abgebaut und in Hefezellen, die mit einem nicht-funktionellen NMD Wegs stabilisiert. So sind die Halbwertszeiten der mRNAs, die direkte Ziele dieses Weges sind in Wildtyp-Hefe cel kürzerls gegenüber Hefezellen mit einer nicht funktionsfähig NMD Weg.

Protokoll

1. Wachstum von Hefezellen

1. Wählen Sie die entsprechenden Hefestämme für die mRNA-Zerfall Leistungsmessungen genutzt werden. Um die Transkription zu hemmen mit dem temperaturempfindlichen Allel der RNA-Polymerase II, verwenden Hefe Stämmen, die das rpb1-1 Mutation ^1. Erhalten dieses Hefestammes aus einem Labor, das bereits eine oder erzeugt es im Labor unter Verwendung von Standardverfahren, wenn eine spezifische genetische Hintergrund benötigt ^9.
2. Unter Einhaltung steriler Techniken vorzubereiten Hefe Medien Verwendung von Standardverfahren ^10. Wenn keine Auswahl erforderlich ist, bereiten Sie Rich-Media wie YPD. Alternativ vorzubereiten selektiven Medien, wenn die Hefezellen werden mit Plasmiden und Selektions transformiert erforderlich. Autoklavieren den Medien.
3. Wachsen die Hefezellen bei 28 ° C, den der permissiven Temperatur für diesen Hefestamm. Tun Sie dies in zwei Schritten:
   1. Zum ersten O / N, wachsen die Hefezellen in 5 ml Wachstumsmedium, um eine Sättigung.
   2. Richten Sie die zweite O / N am Ende des zweiten Tages. Für den zweiten O / N inokulieren unterschiedliche Mengen von Hefezellen aus dem ersten O / N in 100 bis 150 ml Wachstumsmedium (im Bereich von 100 ul bis 1 ml, 2 ml oder mehr, je nachdem, wann die Hefezellen sein müssen geerntet am nächsten Tag). Diesen Schritt, um sicherzustellen, dass eine der Kulturen in der richtigen OD ₆₀₀ des folgenden Tages.

2. Ernte die Hefezellen

1. Bereiten Sie, um die Hefezellen zu ernten. Das Timing für diesen Schritt ist kritisch; beschriften alle erforderlichen Rohre und sammeln alle notwendigen Geräte und Materialien an einem Ort. Vorzuheizen einem Wasserbad auf 39 ° C vorheizen zwei 15-ml-Teströhrchen aus dem Wachstumsmedium bei 28 ° C und bei 60 ° C.
   HINWEIS: Die 15 ml Wachstumsmedium Volumen kann je nach der Anzahl von Zeitpunkten die Zellen geerntet werden variiert werden.
2. Ernten der Hefezellen, wenn sie eine OD ₆₀₀ erreicht von 0,4 bis 0,7. Transfer die Zellen 4-6 sterile 50 ml Schraubverschluss-Flaschen. Zentrifuge bei 7.500 x g in einer Ultrazentrifuge für 5 Minuten bei RT.
3. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Pellets in den 15 ml Wachstumsmedium, das bei 28 ° C äquilibriert wurde. Pool der Hefezellen in einem sterilen 250 ml-Kolben und ins Gleichgewicht kommen sie für ca. 5 min bei 28 ° C Wachstumstemperatur.
4. Nachdem die Hefezellen bei der Wachstumstemperatur ins Gleichgewicht gebracht, sofort fügen Sie die 15 ml Wachstumsmedium bei 60 ° C ins Gleichgewicht gebracht, die Temperatur auf 39 ° C (der nicht-permissiven Temperatur) zu erhöhen und die Flasche sofort legen im 39 ° C Wasserbad . Stellen Sie sicher, dass das Kulturmedium verbleibt in der 39 ° C-Wasserbad während der restlichen Zellernte Schritte, um sicherzustellen, dass die Transkription abgeschaltet wird.
5. Ernten Sie die Zellen zu verschiedenen Zeiten nach dem Platzieren des Kolbens im 39 ° C Wasserbad. Zum ersten Zeitpunkt, Ernte der Zellen unmittelbar nach dem Einlegen des Kolbens bei 39 & #176; C. Ernten Sie eine 3-ml-Aliquot und verteilen Sie die 3 ml in zwei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen für 10 Sekunden in einem Mini-Zentrifuge oder picofuge mit Schnellbremsung und gießen Sie den Überstand.
6. Sofort gefrier des Pellets in einem Trockeneis / Ethanol-Bad oder in flüssigem Stickstoff. Festlegen des ersten Zeitpunkt die Zellen bei als Zeitpunkt Null geerntet.
7. Die Zeitpunkte werden die Zellen bei danach geerntet experimentell zu bestimmen, indem ein Pilotversuch abhängig von den mRNAs von Interesse. Normalerweise Ernte Hefezellen zu folgenden Zeitpunkten: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 und 35 min (2B). Wenn die mRNA Halbwertszeit kann nicht mit den oben genannten Zeitpunkten ermittelt werden, passen diese Zeitpunkte. Zum Beispiel kann für mRNAs mit erwarteten kurzen Halbwertszeiten, zu verwenden kürzere Zeiten Punkten (dh 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 und 18 min) und für mRNAs mit erwarteten langen Halbwertszeiten, zu verlängern die Zeitpunkte.
8. Nachdem die Zellen harvested, speichern sie in einem -80 ° C Gefrierschrank bis RNA-Extraktion durchgeführt wird.

3. Extrahieren von RNA aus den Hefezellen

1. Für die RNA-Extraktion Teil des Protokolls verwenden RNase freien Techniken, um den Abbau der RNA durch RNasen zu verhindern. Bereiten RNase freien Lösungen, Glas- und Plastikwaren, um die Extraktion der RNA verwendet werden.
2. Extrahieren der RNA aus den Hefezellen nach Standardprotokollen. In der Regel verwenden Sie den heißen Phenolverfahren ^12. Alternativ verwenden Kits, die verwendet werden können, um RNA aus Hefezellen extrahieren.
3. Bestimmen die Menge und Reinheit der RNA, die normalerweise durch die Messung der Absorption bei A ₂₆₀ und A ₂₈₀ von 2 & mgr; l von RNA unter Verwendung einer Nanodrop. Bestimmung der Konzentration der RNA aus dem A _260. Auf der Grundlage der Konzentration verdünnen RNA bis 1 ug / ul mit DEPC behandeltem Wasser.
   HINWEIS: Das Verhältnis von A ₂₆₀ / A ₂₈₀ liefert Informationen über ter die Reinheit der RNA. Eine RNA-Probe ist rein, wenn die A ₂₆₀ / A ₂₈₀ Verhältnis beträgt 2,0 ± 0,1.

4. Northern-Blot-Analyse

HINWEIS: Northern Blots auf mRNA-Spiegel zu quantifizieren und zu erhalten Informationen über die Größe der Transkripte. Darüber hinaus verwenden Northern Blots, um mRNAs, die mehrere Isoformen von derselben mRNA produzieren zu erkennen.

1. Bereiten Sie eine 1,0% Agarose-Formaldehyd-Gel. Führen gleiche Mengen der Proben-RNA an der Agarose-Formaldehyd-Gel durch Elektrophorese nach Standardprotokollen ^12. Führen Sie einen RNA-Leiter neben den RNA-Proben und es verwenden, um die Größe der RNA, die auf dem Northern Blot erkannt zu bestimmen. Vor der Übertragung der RNA auf der Agarose-Formaldehyd-Gel auf eine Membran getrennt sind, schneiden Sie die Spur mit der RNA-Leiter aus dem Gel und visualisieren mit Ethidiumbromid.
   HINWEIS: Alternativ kann das ganze Gel mit Ethidiumbromid vor dem Transfer der RNA gefärbt werden.
2. Aach dem RNA-Proben wurden auf einen geeigneten Abstand auf dem Gel migriert, übertragen Sie die RNA auf eine Membran mit RNase freien Techniken. Verwenden Sie eine von mehreren Protokollen zur Verfügung RNA Membranen ^12-13 übertragen. Um die RNA auf eine Membran übertragen, schneiden sich die Membran in etwa die gleiche Größe wie das Gel. Übertragen der RNA nach Standardprotokollen ^12.
3. UV Vernetzung der RNA an die Membran unter Verwendung eines UV-Vernetzers gemäß Herstelleranweisungen. Alternativ backen die Membran in einem Ofen auf 80 ° C für 1 Stunde eingestellt. Speicherung der Membran bei -20 ° C in einem Kunststoffbeutel dauernd wiederholt, bis es an spezifischen Sonden hybridisiert wird.
   HINWEIS: Die trockene Membran kann auch bei Raumtemperatur zwischen Filterpapieren aufbewahrt werden.

5. hybridisieren Sonden Ergänzend zu der RNA in der Nähe zu der Membran

ANMERKUNG: Eine Möglichkeit, mRNA auf der Membran zu erkennen ist die ³² P-markierte DNA-Sonden hybridisieren. ACHTUNG: Researchers Arbeit mit ³² P müssen Schutzverfahren zu verwenden, um eine Kontamination zu verhindern. Folgen Sie den Richtlinien des Instituts über die Verwendung von radioaktivem Material.

1. Bereiten Sie die DNA-Sonde durch Markieren von 25 - 50 ng der DNA an der Membran gemß Standardprotokollen ¹² hybridisiert werden. Generieren Sie die DNA-Fragment durch PCR oder Plasmid Verdauung. Bestimmung der spezifischen Aktivität der DNA-Sonde durch das Zählen 1 ul des radioaktiv markierten DNA-Sonde nach der eingebauten Nukleotide werden entfernt, ^12.
2. Vorheizen Vorhybridisierung / Hybridisierungspuffer bei 42 ° C. Verwenden ~ 10 ml der Vorhybridisierung / Hybridisierungspuffer auf 100 cm ² der Membran ^12.
3. Hybridisieren 1-5 x 10 ⁶ cpm der radioaktiv markierten DNA-Sonde pro ml Hybridisierungspuffer zu dem Membran O / N in einem Hybridisierungsofen zur mRNA von Interesse ¹² zu detektieren. Sicherstellen, dass während der Hybridisierung die Hybridisierungsofen Drehung in einer Richtung,bewirkt, daß die gesamte Membran mit der Hybridisierungslösung ausgesetzt werden, um eine ordnungsgemäße Hybridisierung zu gewährleisten.
4. Zwei Mal Waschen der Membran bei Raumtemperatur für 15 min mit 50 ml 2x SSPE und einmal bei 65 ° C mit 50 ml 2x SSPE / 2% SDS für 15 min ^12. Wickeln Sie die Membran in der Plastikverpackung, damit es nicht austrocknet oder verunreinigen das Phosphor-Bildschirm.
5. Verwendung eines Geigerzählers, eine Schätzung der Intensität der Radioaktivität auf der Membran.
   ANMERKUNG: Diese Schätzung stellt sicher, dass die Membran an dem Phosphorbildschirm für die entsprechende Zeitdauer ausgesetzt. Verwenden längere Belichtungszeiten für Membranen mit geringen Mengen an Radioaktivität.
6. Für Northern Blots, verwenden Sie eine Ladekontrolle, um zu bestätigen, dass gleiche Mengen von RNA werden an jedem Ort geladen. Um dies zu tun, Streifen der Membran und Reprobe es mit einer RNA, die nicht betroffen ist durch den Prozess untersucht. Entfernen Sie die Membran, indem sie in einer Glasschale, die 200 ml kochendes Entfernungslösung (0,1% SDS / 0,01 XSSC) für 2 min. Gießen Sie das Ablöselösung und wiederholen Sie den Vorgang fünfmal ^12.
   HINWEIS:. Ein Beispiel für ein RNA als Ladekontrolle verwendet wird SCR1 SCR1 ist ein RNA-Polymerase III-Transkripts, die stabil und reichlich ist SCR1 RNA Fluss sollte bei kurzen RNA-Polymerase II-Inhibierung nicht signifikant verändert..

6. Quantifizierung der RNA, die an die Membran gebunden ist,

HINWEIS: Um die Menge an Radioaktivität zu quantifizieren auf Membran, setzen die Membran auf eine Phosphor-Bildschirm. Nach der entsprechenden Belichtungszeit, scannen den Leuchtstoffschirm mit einem Phosphor.

1. Scannen Sie den Phosphor-Bildschirm mit den Anweisungen des Herstellers des Phosphor vorgesehen.
2. Quantifizierung der mRNA zu jedem Zeitpunkt. Quantifizieren mRNA-Spiegel mit Imagequant Software oder der zugehörigen Software. Normalisieren der mRNA zu jedem Zeitpunkt an die Ladesteuerung. Wenn SCR1 als das BeladenKontrolle, normalisiert die Halbwertszeit northerns zu SCR1.
3. Die Halbwertszeit der mRNA wird durch Division der Menge an mRNA verbleibenden zu jedem Zeitpunkt durch die Menge der mRNA vorhanden zum Zeitpunkt 0 (der Anfangszeitpunkt) berechnet. Zeichnen Sie die verbleibenden über die Zeit auf einer halblogarithmischen Grundstück (2C) Prozent mRNA. Berechnen mRNA-Halbwertszeiten nach der folgenden Gleichung:
   t _1/2 = -0,693 / k (negative 0,693)
4. k die Steigung der Ausgleichsgeraden und T _1/2 die mRNA-Halbwertszeit.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieses Protokoll, um mRNA Zerfallsraten exakt zu messen, hängt von Hemmung der Transkription, die Ernte von Hefezellen zu den entsprechenden Zeitpunkten, und die Nutzung von RNase freien Techniken beim Extrahieren von RNA und Northern-Blotting. Probing für zwei Steuer mRNAs bekannt instabil und stabil zu sein, bzw. bietet Sicherheit, dass das Experiment funktioniert. Beispielsweise kann dies durch Sondieren mit einer Sonde, die sowohl das CYH2-prä-mRNA und mRNA erkennt erfolgen. ...

Diskussion

Hemmung der mRNA-Synthese und mRNA Überwachung Umsatz in der Abwesenheit von neuen Synthese ist ein Verfahren, das häufig verwendet wird, um die mRNA-Abbauraten zu messen. In S. cerevisiae, ist die Messung der mRNA Zerfallsraten durch Hemmung der Transkription unter Verwendung der temperaturempfindliche Allel von RNA-Polymerase II eine der am häufigsten verwendeten Methoden. Dieses Verfahren hemmt spezifisch die RNA-Polymerase II. Die wichtigsten Schritte zur Bestimmung von mRNA-Abbauraten mit dieser Technik...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation		Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background