العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

Summary

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Abstract

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Introduction

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

Protocol

يجب مراجعة بروتوكولات لجمع الأنسجة البشرية والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية IRB: ملاحظة. وقد تمت الموافقة على مجموعة من التخلص منها، الأنسجة البشرية التي تم تحديدها من قبل دي مستشفى بوسطن للأطفال ومستشفى بريجهام للنساء في اللجان IRB. وقد طبقت الطرق الموضحة أدناه لعزل خلايا المنشأ العضلي من دي تحديدها، التخلص من الأنسجة. الأساليب المذكورة تنطبق على الأنسجة التي تم جمعها من المواد المرضى وافق.

1. عزل خلية

1. تفكك خزعة العضلات وتنقية خلايا المنشأ العضلي
   1. قبل تزن لوحة زراعة الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية هود زراعة الأنسجة، ومن ثم إعادة تزن-لوحة تحتوي على خزعة العضلات لحساب كمية الأنسجة ليتم فصلها.
   2. باستخدام المشارط معقمة، الأنسجة العضلية اللحم المفروم ناعما وإضافة بضع قطرات من معقم 1X HBSS لمنع الأنسجة من الجفاف.
   3. إضافة 3.5 مل كل من ديspase الثاني وكولاجيناز D في كل غرام من الأنسجة العضلية ليتم هضمها. ماصة الأنسجة المفروم وحل الانزيم من خلال العقيمة 25 مل ماصة عدة مرات. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 15 دقيقة وهضم الأنسجة حتى الطين يمر بسهولة على الرغم من معقمة 5 مل ماصة.
      وعادة ما يتحقق الأنسجة التفكك عن طريق الهضم الأنزيمي داخل 45-90 دقيقة: ملاحظة. يرجى الرجوع إلى قسم "ممثل النتائج" للحصول على تفاصيل إضافية.
   4. إضافة 2 مجلدات من متوسط ​​النمو معقم للأنسجة فصلها، ومرشح من خلال مصفاة 100 ميكرون الخليوي أكثر من 50 مل الخلايا المخروطية أنبوب وبيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة)، درجة حرارة الغرفة. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
   5. resuspend الكرية في 1 حجم معقم متوسطة النمو وإضافة 7 مجلدات الأحمر حل الخلية تحلل الدم. تصفية حل من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر، ثم بيليه رانه الخلايا لمدة 10 دقيقة في 329 x ج، درجة حرارة الغرفة.
   6. عدد الخلايا في عدادة الكريات و resuspend الخلايا في 1X HBSS 0.5٪ BSA بتركيز 1 × 10 ⁶ خلية / 100 ميكرولتر. جانبا 250،000 الخلايا في أنبوب واحد التي سيتم استخدامها بوصفها سلبية (غير ملوثين) مراقبة ~. تعيين أحادية اللون أنابيب السيطرة الملون جانبا إضافية ليوديد propidium وCD56، وهي مطلوبة من أجل النابضة السليم للخلايا إيجابية CD56 بواسطة FACS الفرز. يرجى الرجوع إلى الخلية أدلة الفرز أو التشاور مع تدرج FACS فرز خبراء منشأة الأساسية لضمان الضوابط المناسبة.
   7. وصمة عار على الخلايا ليتم فرزها مع 5μl / 10 ⁶ خلايا لمكافحة CD56 الأجسام المضادة. احتضان جميع العينات (بما في ذلك الضوابط) على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   8. عينات غسيل في 10 مل 1X HBSS وخلايا بيليه لمدة 10 دقيقة في 329 x ج (~ 1،100 دورة في الدقيقة) في أجهزة الطرد المركزي المبردة، 4 ° C درجة الحرارة.
   9. إضافة يوديد propidium بتركيز نهائي من 1μg / مل للعينة أن يكون سورتيد لاستبعاد الخلايا الميتة. تنقية خلايا إيجابية CD56 المنشأ العضلي من الخلايا غير المنشأ العضلي باستخدام مضان تنشيط خلية فارز.
2. تفكك خزعة الجلد
   ملاحظة: الجلد الخلايا الليفية يمكن عزلها من لكمة الجلد من المرضى عندما الخزعات العضلية غير متوفرة. الخلايا الليفية الجلدية ويمكن استخدام مادة بيولوجية للعديد من الدراسات، بما في ذلك التنبيغ مع MyoD على توليد خلايا المنشأ العضلي. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الليفية الجلدية يمكن استخدامها لتوليد خلايا الجذع، والتي يمكن أن تكون متباينة في مختلف أنواع الخلايا لمزيد من الدراسة.
   1. نقل خزعة الجلد إلى المختبر في وسط النقل. وبمجرد استلام العينة، نفذ ثقافة الأولية في أقرب وقت ممكن. إذا لا يمكن تأسيس ثقافة الأولية في نفس اليوم، وتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   2. نقل خزعة الجلد لالعقيمة 35 ملم طبق بتري في غطاء تدفق الصفحي.
   3. شطف خزعة الجلد في طبق بتري مع معقم 1س PBS لإزالة الدم والحطام. إزالة الأنسجة الدهنية مع مشرط معقم.
   4. إضافة 2 مل من محلول كولاجيناز واللحم المفروم مع النسيج مشرط، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على حجم الأنسجة.
   5. نقل الأنسجة هضمها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وشطف طبق بتري مع 2 مل من ثقافة الخلايا الليفية المتوسطة مرتين، وجمع المتوسطة في نفس الأنبوب.
   6. بيليه الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   7. تجاهل طاف ويغسل بيليه مع 3 مل من الخلايا الليفية المتوسطة لإزالة كولاجيناز، ثم خلايا بيليه مرة أخرى. يرجى الرجوع إلى الجدول المواد اللازمة لتكوين وسائل الإعلام.
   8. كرر الخطوة 1.2.7 مرة أخرى.
   9. اعادة تعليق بيليه في الخلايا الليفية المتوسطة وصفيحة 5 مل في الصعود إلى T25 نسيج الثقافة العقيمة القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
   10. تقييم ثقافة لمرفق الخلايا الليفية والنمو خلال الايام المقبلة 1-3. <ر /> ملاحظة: بعض قطع الأنسجة الصغيرة قد تعلق أيضا على لوحة والخلايا الليفية تهاجر من هذه القطع الأنسجة.
   11. الحفاظ على الثقافة في ظل نفس الظروف حتى تزرع الخلايا الليفية إلى ما يقرب من 80٪ التقاء.
   12. جمع الخلايا الليفية من قبل trypsinization ونقل على قوارير ثقافة جديدة للتوسع إضافي. أداء trypsinization بغسل الثقافات 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم ^{++ ++.} إضافة التربسين-EDTA (الجدول انظر المواد) إلى الخلايا (2ML / T25 القارورة) لمدة 2 دقيقة عند 37 ° C.
   13. انقسام خلايا منفصلة في قوارير إضافية. وإذا كان بعض قطع الأنسجة لا تزال تعلق على قوارير T25 الأصلية، إضافة 5 مل ثقافة جديدة متوسطة إلى هذه القارورة وسوف المزيد من الخلايا الليفية تهاجر خارج باستمرار.
       ملاحظة: ثقافة الخلايا الليفية موسعة يمكن تجميد منصبه كرئيس P1 وتخزينها في النيتروجين السائل للتجارب المستقبلية.

2. تخليد خلايا عضلي

1. لوحة الخلايا 5 ملايين فينيكس Ecotropic التعبئة والتغليف (PE) بين عشية وضحاها في 10 سم معقمة لوحة زراعة الأنسجة في DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 10٪ العجل المصل.
2. خلايا تغذية 30 دقيقة قبل ترنسفكأيشن مع 5 مل من وسائل الإعلام الجديدة تستكمل مع 10 ملي الكافيين.
3. التجانس خليط من 2 ميكروغرام من DNA البلازميد من الإعدادية ميدي (CDK4 أو hTERT بلازميد) وpolyjet ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
4. يضاف خليط بلازميد / polyjet إلى خلايا PE بين عشية وضحاها.
5. خلايا تغذية مع المتوسطة الطازجة (DMEM والمتوسطة 199 في نسبة 4: 1، على أن تستكمل مع 10٪ مصل العجل). في وقت لاحق اثنتي عشرة ساعة، وجمع طاف التي تحتوي على الفيروس وتصفية من خلال حجم مرشح 0.45 ميكرون المسام.
6. استخدام 1 مل من طاف جمعها على إصابة بين عشية وضحاها خط PA317 خلية التعبئة والتغليف amphotropic ⁵ و الحصول على خط الخلية المنتجة للفيروس مستقر بعد اختيار إما 0.5 ملغ / مل النيوميسين (G418) لCDK4 أو 0.5 ملغ / مل هيغروميسين لhTERT.
7. إعداد العمل supernatants الفيروسية من خلال زراعة الخلايا التعبئة والتغليف مستقرة لالقريب confluency، ثم حصاد طاف كل صباح، مساء وصباح لمدة ثلاثة مواسم الحصاد.
8. تصفية supernatants الفيروسية وإما استخدام مباشرة أو تقسيمها إلى 1 مل مأخوذة وتخزينها في -80 ° C لاستخدامها لاحقا. لاحظ أن طاف الفيروسي يفقد 50٪ كفاءة العدوى مع بعضها تجميد ذوبان الجليد. تذكر لتبييض غسل قبل رميه كل ما لمست الجسيمات الفيروسية.
   ملاحظة: مستقر PA317 الفيروسات خط انتاج الخلايا يمكن تجميد والحفاظ على -150 درجة مئوية لمدة التخزين الدائم (تجميد المتوسطة هو 10٪ DMSO و 90٪ مصل).
9. لوحة-FACS تنقية خلايا المنشأ العضلي (موضح في الخطوات 1،1-1،9) في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 ⁴ خلايا / جيد في 6 لوحات جيدة المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين. ضمان المرفقة الخلايا إلى لوحة قبل المضي قدما في عدوى فيروسية.
10. إضافة 400 ميكرولتر تصفيتها، وأنتجت reshly طاف الفيروسية أو مأخوذة المجمدة إلى كل لوحة ستة جيدا بين عشية وضحاها (الحفاظ على 2 الآبار والضوابط).
11. تغيير المتوسطة عن طريق تغذية الخلايا مع 2.5 مل / جيد من وسائل الاعلام الطازج العضلات (4: 1 Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) والمتوسطة 199 تستكمل مع 15٪ مصل بقري جنيني، 0.02 M HEPES العازلة؛ 1.4 ملغم / لتر فيتامين B12، 0.03 ملغ / L ZnSO4، 0.055 ملغ / L ديكساميثازون 2.5 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الكبدية و 10 ميكروغرام / لتر عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية). تجاهل وسائل الإعلام والماصات التي تحتوي على جسيمات فيروسية في وعاء التبييض. ترك الخلايا في نفس متوسطة لمدة 3 أيام للتعافي من الإصابة، ثم علاج لاختيار إما باستخدام 400 ميكروغرام / مل النيوميسين (عدوى CDK4) أو 300 ميكروغرام / مل هيغروميسين (عدوى hTERT).
12. الحفاظ على الخلايا تحت اختيار المخدرات حتى الخلايا في الطبق يموت التحكم (1-2 أسابيع).
13. خلايا مرور قبل أن تصبح متكدسة (60-80٪ confluency، واستخدام 0.05٪ التربسين EDTA)، حتى خلال selectiعلى الفترة. خلايا Replate في 10CM متعددة الأطباق مع المتوسطة بالخلايا العضلية الجذعية الطازجة (كما هو موضح في 2.11) تستكمل مع الدواء الاختيار. الحفاظ على الخلايا المحددة خلد باعتباره السكان غير متجانسة أو استنساخ للحصول على الخلفية الوراثية متجانسة تماما (نفس الإدراج من التحوير في كل خلية).
14. أداء اختيار نسيلي باستخدام الخطوات التالية:
    1. البذور الخلايا في كثافة منخفضة (مثل 300 و 500 الخلايا في 10 سم أطباق) والمحافظة عليها لمدة أسبوعين تقريبا، حتى يتم تشكيل مستعمرات صغيرة (10-20 الخلايا).
    2. إزالة معظم المتوسطة في هذه المرحلة، ولم يتبق سوى طبقة رقيقة لمنع الخلايا من الجفاف.
    3. ضع حلقة الاستنساخ (مع نهاية واحدة مغموسة في سيليكون الشحوم فراغ) على كل استنساخ المطلوب وإضافة بضع قطرات من التربسين / EDTA.
    4. حصاد الخلايا بمجرد أن تصبح تقريب بواسطة الشفط بعناية الخلايا باستخدام طرف 1 مل أو الماصة باستور وتحويلها إلى أصغر جيش التحرير الشعبى الصينى multiwell متاحالشركة المصرية للاتصالات (96 أو 48، 24 أو 12 لوحات جيدا).
    5. توسيع استنساخ حسب الحاجة لمنع confluency المحلي.

النتائج

ويوضح الشكل (1) بعض الخطوات الرئيسية المشاركة في التفكك النسيج الأساسي: يتم وزن المبلغ المحدد من الأنسجة في طبق بتري معقمة زراعة الأنسجة (الشكل 1A، B). ثم يتم مفروم ناعما النسيج باستخدام المشارط معقمة، حتى يتم الحصول على الطين الأنسجة (الشكل 1C، D).

Discussion

الخلايا كما مصدرا مفيدا

العزلة وثقافة السكان الخلية عضلي مفيد للغاية عند إنشاء الظواهر المرض أو في نماذج المختبر من المرض. الإجراء العزلة خلية عضلي الموصوفة هنا يسمح للعزل myoblasts والخلايا الليفية من العينات العضلات وال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010