Isolement et immortalisation de lignées cellulaires de patients dérivé de la biopsie musculaire pour la modélisation des maladies

Résumé

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Résumé

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Introduction

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

Protocole

NOTE: Protocoles pour la collecte de tissus humains doivent être examinés et approuvés par le comité institutionnel de la CISR. Collection de rebut, les tissus humains de-identifié a été approuvé par l'Hôpital pour enfants de Boston et des comités hôpital Brigham and Women de la CISR. Les méthodes décrites ci-dessous ont été appliquées pour l'isolement de cellules myogéniques de dépersonnalisés, jetés tissus. Les méthodes décrites sont applicables aux tissus prélevés à partir de matériaux patients consenti.

1. Isolement cellulaire

1. La dissociation de la biopsie musculaire et la purification de cellules myogéniques
   1. Pré-peser un tissu plaque de culture de 10 cm dans une culture tissulaire biosécurité capot, puis re-peser la plaque contenant la biopsie musculaire pour calculer la quantité de tissu à être dissocié.
   2. Utilisation de scalpels stériles, tissus mince musculaire finement et ajoutez quelques gouttes de HBSS stérile 1x à empêcher le tissu de se dessécher.
   3. Ajouter 3,5 ml chacune de dispase II et de la collagénase D par gramme de tissu musculaire à être digérés. Pipeter le tissu haché et une solution d'enzyme à travers une pipette de 25 ml stérile à plusieurs reprises. Incuber la plaque dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C avec 5% de CO ₂ pendant 15 minutes et à digérer le tissu jusqu'à ce que la suspension passe facilement si une pipette stérile 5 ml.
      REMARQUE: la dissociation des tissus est habituellement obtenue par digestion enzymatique dans les 45 à 90 min. Se il vous plaît se référer à la section 'Les résultats représentatifs de pour plus de détails.
   4. Ajouter deux volumes de milieu de croissance stérile à un tissu dissocié, filtre à travers un tamis de 100 um de la cellule sur une 50 ml à tubes coniques et granulés pendant 10 min à 329 x g (~ 1100 tours par minute), la température ambiante. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
   5. Remettre en suspension le culot dans 1 volume de milieu de croissance stérile et ajouter sept volumes solution rouge sang de lyse cellulaire. Filtrer la solution à travers un tamis cellulaire 40 um, puis sédimenter tes cellules pendant 10 min à 329 xg, la température ambiante.
   6. Compter les cellules dans un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules dans du HBSS 1x 0,5% de BSA à une concentration de 1 x 10 ⁶ cellules / 100 ul. Mettez de côté ~ 250 000 cellules dans un seul tube qui seront utilisés comme un contrôle négatif (non colorées). Régler une seule couleur colorées tubes de contrôle de côté supplémentaires pour l'iodure de propidium et de CD56, qui sont nécessaires pour le bon déclenchement de cellules positives CD56 par tri FACS. Se il vous plaît se référer à la cellule manuels de tri ou de consulter FACS tri experts des installations de base pour assurer des contrôles appropriés sont inclus.
   7. Colorer les cellules à trier avec 5 pi / 10 ⁶ cellules d'anticorps anti-CD56. Incuber tous les échantillons (y compris les contrôles) sur la glace pendant 30 min.
   8. Laver les échantillons dans 10 ml 1x HBSS et un culot de cellules pendant 10 min à 329 xg (~ 1100 rpm) dans une centrifugeuse réfrigérée, 4 ° C la température.
   9. Ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml de l'échantillon à être sorTed d'exclusion des cellules mortes. On purifie des cellules positives CD56 de cellules myogéniques non myogéniques en utilisant le trieur de cellules activé par fluorescence.
2. La dissociation de la biopsie de la peau
   NOTE: fibroblastes dermiques peuvent être isolés à partir d'un coup de poing de la peau des patients lors des biopsies musculaires ne sont pas disponibles. Les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés comme biomatériau pour de nombreuses études, y compris la transduction avec MyoD pour générer des cellules myogéniques. En outre, les fibroblastes dermiques peuvent être utilisés pour générer des cellules iPS, qui peuvent être différenciées en divers types de cellules pour une étude plus approfondie.
   1. Transports la biopsie de la peau au laboratoire dans un milieu de transport. Une fois que l'échantillon est reçu, effectuer la culture primaire dès que possible. Si la culture primaire ne peut être établie le même jour, stocker l'échantillon à température ambiante jusqu'au lendemain.
   2. Transférer la biopsie de la peau à une boîte de Pétri de 35 mm dans la hotte stérile à flux laminaire.
   3. Rincer la biopsie de la peau dans une boîte de Pétri avec une stérilex PBS pour éliminer le sang et les débris. Retirer le tissu adipeux avec un scalpel stérile.
   4. Ajouter une solution de collagénase de 2 ml et hacher le tissu avec un scalpel, incuber à 37 ° C pendant 45 min à 1 h, en fonction de la taille du tissu.
   5. Transférer le tissu digéré dans un tube conique de 15 ml, rincer la boîte de Pétri avec 2 ml de milieu de culture de fibroblastes de deux fois, et de recueillir le milieu dans le même tube.
   6. Pellet les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante.
   7. Jeter le surnageant et laver le culot avec 3 ml de milieu de fibroblastes de retirer la collagénase, puis les cellules granules nouveau. Se il vous plaît se référer à la table des matières pour la composition des médias.
   8. Répétez l'étape 1.2.7 une fois de plus.
   9. Remettre en suspension le culot dans des cellules de fibroblastes de taille et de la plaque 5 ml sur un T25 culture tissulaire stérile ballon. Incuber le flacon à 37 ° C avec 5% de CO _2.
   10. Évaluer la culture pour la fixation des fibroblastes et la croissance au cours des 1-3 prochains jours.
       NOTE: Certains petits morceaux de tissus peuvent également se attacher à la plaque et les fibroblastes migrer hors de ces morceaux de tissu.
   11. Maintenir la culture dans les mêmes conditions jusqu'à ce que les fibroblastes sont cultivés jusqu'à confluence d'environ 80%.
   12. Recueillir fibroblastes par trypsinisation et transfert sur des flacons de culture frais d'expansion supplémentaire. Effectuer trypsinisation par lavage des cultures 3 fois en PBS 1x sans Ca ⁺⁺ et Mg ^++. Ajouter la trypsine-EDTA (voir Matériaux Table) pour les cellules (2 ml / fiole T25) pendant 2 minutes à 37 ° C.
   13. Diviser les cellules individuelles dans des flacons supplémentaires. Si des morceaux de tissu restent attachés aux flacons T25 originaux, ajouter 5 ml de milieu de culture frais à ce ballon en plus de fibroblastes migrent hors continuellement.
       NOTE: La culture de fibroblastes élargi peut être congelé bas que P1 et stocké dans l'azote liquide pour des expériences futures.

2. L'immortalisation des cellules myogéniques

1. cellules Plate 5000000 Phoenix écotrope emballage (PE) la nuit dans une plaque de culture de tissu de 10 cm stérile dans DMEM et moyennes 199 dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de veau à 10%.
2. les cellules d'alimentation 30 min avant la transfection avec 5 ml de milieu frais supplémenté avec 10 mM de caféine.
3. Homogénéiser un mélange de 2 pg d'ADN de plasmide à partir d'une préparation midi (CDK4 ou plasmide hTERT) et Polyjet et incuber à température ambiante pendant 15 min, tel que recommandé par le fabricant.
4. Ajouter le mélange plasmide / Polyjet aux cellules PE nuit.
5. Cellules nourrir avec du milieu frais (DMEM et moyennes 199 dans un rapport de 4: 1, complété avec du sérum de veau à 10%). Douze heures plus tard, recueillir le surnageant contenant le virus et la filtrer à travers un filtre de taille de pore de 0,45 um.
6. Utiliser 1 ml de surnageant recueilli pendant une nuit à infecter la cellule d'encapsidation amphotrope PA317 ligne ⁵ et à obtenir une lignée de cellules productrices de virus stables après sélection avec soit 0,5 mg / ml de néomycine (G418) pour CDK4 ou 0,5 mg / ml d'hygromycine pour hTERT.
7. Préparer travailler surnageants viraux par la croissance des cellules d'emballage stables à près de confluence, puis en récoltant le surnageant chaque matin, soir et matin pour trois récoltes.
8. Filtrer les surnageants viraux et soit utiliser directement ou de les diviser en aliquots de 1 ml et conserver à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Notez que surnageant viral perd 50% d'efficacité de l'infection par chacun de congélation-décongélation. Ne oubliez pas de blanchir de lavage avant de jeter tout ce qui a touché les particules virales.
   NOTE: La lignée cellulaire PA317 virus produisant stable peut être congelé et maintenu à -150 ° C pour le stockage permanent (milieu de congélation est de 10% de DMSO; 90% de sérum).
9. Plate-purifiée FACS des cellules myogéniques (décrite dans les étapes 1.1 à 1.9) à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / puits dans des plaques à 6 puits revêtues de gélatine à 0,1%. Se assurer que les cellules sont fixées à la plaque avant de procéder à l'infection virale.
10. Ajouter 400 ul filtré, freshly produit surnageant viral ou aliquotes congelées à chaque plaque à six puits nuit (garder deux puits comme témoins).
11. Changer moyen en alimentant les cellules avec 2,5 ml / puits de milieu frais musculaire (4: 1 de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) et le milieu 199 supplémenté avec du sérum bovin fœtal à 15%; 0,02 M tampon HEPES; 1,4 mg / L de vitamine B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L de dexaméthasone, 2,5 ug / l facteur de croissance des hépatocytes et 10 ug / L fibroblastes basique facteur de croissance). Jeter les médias et les pipettes contenant les particules virales dans un récipient de blanchiment. Laissez cellules dans le même milieu pendant 3 jours pour se remettre de l'infection, puis traitent pour la sélection en utilisant soit 400 pg / ml de néomycine (infection de CDK4) ou 300 pg / ml d'hygromycine (infection de hTERT).
12. Maintenir cellules dans la sélection des médicaments jusqu'à ce que les cellules dans le plat de commande filière (1-2 semaines).
13. Passage cellules avant qu'elles ne deviennent confluentes (60-80% de confluence; utilisant 0,05% de trypsine EDTA), même pendant la selectisur la période. Réensemencement cellules dans plusieurs plats 10cm avec un milieu de myoblastes frais (comme décrit dans 2.11) complétés avec le médicament de sélection. Maintenir des cellules immortalisées sélectionnées comme étant une population hétérogène ou cloner d'obtenir un fond génétique complètement homogène (même de l'insertion du transgène dans chaque cellule).
14. Effectuer la sélection clonale utilisant les étapes suivantes:
    1. Ensemencer les cellules à une faible densité (par exemple 300 à 500 cellules dans des plats de 10 cm) et les maintenir pendant environ deux semaines, jusqu'à ce que de petites colonies sont formées (10 à 20 cellules).
    2. Enlever la plupart du milieu à ce point, laissant seulement un film mince pour empêcher les cellules de se dessécher.
    3. Placez un anneau de clonage (avec une fin trempé dans la graisse à vide de silicone) sur chaque clone désiré et ajouter quelques gouttes de trypsine / EDTA.
    4. cellules de récolte une fois qu'ils sont arrondis en aspirant soigneusement les cellules en utilisant une pointe de 1 ml ou une pipette Pasteur et de les transférer à la plus petite pla multipuits disponibleste (96 ou 48, ou 24 plaques de 12 puits).
    5. Développer clones comme nécessaire pour éviter la confluence locale.

Résultats

La figure 1 illustre certaines des étapes clés impliquées dans la dissociation de tissu primaire: le montant exact du tissu est pesé dans un plat culture de tissus de Pétri stérile (Figure 1A, B). Le tissu est ensuite finement hachée à l'aide de scalpels stériles, jusqu'à ce qu'une suspension de tissu est obtenu (figure 1C, D). Après l'addition des enzymes de la digestion, les muscles primaire dissociation tissulaire est habituellement obtenue...

Discussion

Cellules comme une ressource utile

L'isolement et la culture de populations de cellules myogéniques est extrêmement utile lors de l'établissement des phénotypes de la maladie ou dans des modèles in vitro de la maladie. La procédure d'isolement des cellules myogéniques décrite ici permet l'isolement des myoblastes et fibroblastes à partir d'échantillons de muscle squelettique, qui peuvent ensuite être propagées, différenciée, ou immédiateme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010