Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Riepilogo

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Abstract

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Introduzione

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

Protocollo

NOTA: I protocolli per la raccolta di tessuti umani devono essere esaminati e approvati dal comitato istituzionale IRB. Raccolta di scartati, tessuti umani de-identificato è stato approvato dal Children Hospital di Boston e Brigham and Women Hospital IRB Comitati. I metodi descritti di seguito sono stati applicati per l'isolamento di cellule miogeniche da de-identificati, scartato il tessuto. I metodi descritti sono applicabili ai tessuti raccolti da materiale paziente acconsentito.

Isolamento 1. Cella

1. La dissociazione della biopsia muscolare e purificazione di cellule miogeniche
   1. Pre-pesare un tessuto piastra di coltura 10 centimetri in una cappa coltura tissutale biosicurezza, e poi ri-pesare il piatto contenente la biopsia muscolare per calcolare la quantità di tessuto da dissociato.
   2. Utilizzando bisturi sterili, il tessuto muscolare tritare finemente e aggiungere qualche goccia di sterile 1x HBSS per evitare che il tessuto si secchi.
   3. Aggiungere 3,5 ml ciascuno di dispase II e collagenasi D per grammo di tessuto muscolare per essere digerito. Pipettare il tessuto macinata e soluzione enzimatica attraverso una sterile 25 ml pipetta un paio di volte. Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 15 min e digerire il tessuto fino slurry passa facilmente se un sterile 5 ml pipetta.
      NOTA: tessuto dissociazione avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90 min. Si prega di fare riferimento alla sezione "Risultati Rappresentante 'per ulteriori dettagli.
   4. Aggiungere 2 volumi di mezzo di crescita sterili per tessuti dissociato, filtrare attraverso un filtro 100 micron cellule sopra a 50 ml tubolare e pellet coniche per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm), a temperatura ambiente. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
   5. Risospendere il pellet in 1 volume di mezzo di crescita sterili ed aggiungere 7 volumi soluzione di lisi dei globuli rossi. Filtrare la soluzione attraverso un colino cella 40 micron, quindi pellet tlui cellule per 10 min a 329 xg, temperatura ambiente.
   6. Contare le cellule in un emocitometro e risospendere le cellule in 1x HBSS 0,5% BSA ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / 100 microlitri. Mettere da parte ~ 250.000 cellule in un unico tubo che verranno utilizzati come controllo negativo (senza macchia). Impostare tubi da parte ulteriori monocolore macchiati di controllo per ioduro di propidio e per CD56, che sono necessari per il corretto gating di cellule positive CD56 da FACS ordinamento. Fare riferimento alla cella manuali smistamento o consultare FACS ordinamento esperti core facility per garantire controlli adeguati sono inclusi.
   7. Macchiare le cellule da ordinare con 5μl / 10 ⁶ cellule di anticorpo anti CD56. Incubare tutti i campioni (compresi i controlli) su ghiaccio per 30 min.
   8. Lavare i campioni a 10 ml 1x HBSS e cellule pellet per 10 min a 329 g (circa 1.100 rpm) in una centrifuga refrigerata a 4 ° C di temperatura.
   9. Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 ug / ml per il campione ad essere sorted per l'esclusione di cellule morte. Purificare miogenici CD56 cellule positive dalle cellule non-miogeniche utilizzando la fluorescenza attivato cell sorter.
2. La dissociazione della biopsia cutanea
   NOTA: Dermal fibroblasti possono essere isolati da un pugno di pelle da pazienti quando biopsie muscolari non sono disponibili. Fibroblasti dermici possono essere utilizzati come biomateriale per vari studi, tra trasduzione con MyoD per generare cellule miogeniche. Inoltre, fibroblasti dermici possono essere utilizzati per generare cellule iPS, che possono essere differenziati in vari tipi di cellule per ulteriori studi.
   1. Trasportare la biopsia cutanea al laboratorio di mezzo di trasporto. Una volta ricevuto il campione, effettuare la coltura primaria appena possibile. Se la cultura primaria non è possibile stabilire il giorno stesso, conservare il campione a temperatura ambiente per una notte.
   2. Trasferire la biopsia cutanea di una piastra da 35 mm di Petri sterile nella cappa a flusso laminare.
   3. Sciacquare la biopsia cutanea in una capsula di Petri con sterili 1x PBS per rimuovere il sangue e detriti. Rimuovere il tessuto adiposo con un bisturi sterile.
   4. Aggiungere la soluzione di collagenasi 2 ml e tritare il tessuto con un bisturi, incubare a 37 ° C per 45 minuti a 1 ora, a seconda delle dimensioni del tessuto.
   5. Trasferire il tessuto digerito in una provetta conica da 15 ml, lavare la capsula di Petri con 2 ml di mezzo di coltura di fibroblasti due volte, e raccogliere il fluido nel tubo stesso.
   6. Agglomerare cellule a 200 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   7. Eliminare il surnatante e lavare il pellet con 3 ml di terreno di fibroblasti per rimuovere la collagenasi, poi di nuovo cellule pellet. Si prega di fare riferimento alla tabella dei materiali per la composizione media.
   8. Ripetere il passaggio 1.2.7 ancora una volta.
   9. Risospendere il pellet in cellule medie fibroblasti e la piastra 5 ml su un pallone di coltura di tessuto T25 sterile. Incubare la beuta a 37 ° C con 5% di CO _2.
   10. Valutare la cultura per il fissaggio dei fibroblasti e la crescita nei prossimi 1-3 giorni.
       Nota: alcuni piccoli pezzi di tessuto può anche allegare al piatto e fibroblasti migrare di questi pezzi di tessuto.
   11. Mantenere la cultura nelle stesse condizioni fino fibroblasti sono coltivate a circa l'80% di confluenza.
   12. Raccogliere fibroblasti da tripsinizzazione e trasferire su palloni di coltura fresco per l'espansione ulteriore. Eseguire tripsinizzazione lavando culture 3 volte in 1x PBS libera di Ca ⁺⁺ e Mg ^++. Aggiungere tripsina-EDTA (vedi Materiali Table) alle cellule (2 ml / pallone T25) per 2 minuti a 37 ° C.
   13. Split cellule staccate in fiaschi supplementari. Se alcuni pezzi di tessuto rimangono attaccati ai fiaschi T25 originali, aggiungere 5 ml di terreno di coltura fresco per questo pallone e più fibroblasti migreranno fuori continuamente.
       NOTA: La cultura fibroblasti espansa può essere congelato giù come P1 e conservato in azoto liquido per esperimenti futuri.

2. Immortalizzazione di cellule miogeniche

1. cellule Tavola 5 milioni Phoenix Ecotropic Confezioni (PE) durante la notte in una piastra di coltura tissutale sterili 10 centimetri in DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, integrato con siero di vitello al 10%.
2. Cellule di alimentazione 30 min prima di trasfezione con 5 ml di mezzi freschi integrato con 10 mM di caffeina.
3. Omogeneizzare una miscela di 2 mg di DNA plasmidico da una preparazione midi (CDK4 o hTERT plasmide) e Polyjet ed incubare a temperatura ambiente per 15 min, come raccomandato dal produttore.
4. Aggiungere il composto plasmide / Polyjet alle cellule PE durante la notte.
5. Cellule feed con mezzo fresco (DMEM e Medium 199 in un rapporto di 4: 1, supplementato con siero di vitello al 10%). Dodici ore dopo, raccogliere il surnatante contenente il virus e filtrare attraverso un filtro a 0,45 micron dimensione dei pori.
6. Usare 1 ml di surnatante raccolto di infettare tutta la notte la linea di cellule PA317 confezionamento amphotropic ⁵ e ottenere una linea di virus producono stabile cella dopo la selezione o con 0,5 mg / ml neomicina (G418) per CDK4 o 0,5 mg / ml igromicina per hTERT.
7. Preparare lavoro surnatanti virali coltivando le cellule di packaging stabili nei pressi di confluenza, poi raccogliendo il surnatante ogni mattina, sera e la mattina, per tre raccolti.
8. Filtrare il surnatante virale e utilizzare direttamente o dividerli in aliquote di 1 ml e conservare a -80 ° C per un uso successivo. Si noti che il surnatante virale perde il 50% di efficienza infezione tra gelo e disgelo. Ricordarsi di candeggina-wash, prima di eliminare tutto ciò che ha toccato le particelle virali.
   NOTA: La linea cellulare PA317 virus-produzione stabile può essere congelato e mantenuta a -150 ° C per la memorizzazione permanente (congelamento medio è del 10% DMSO; 90% siero).
9. Cellule miogeniche Piastra FACS-purificato (descritto nei passaggi 1,1-1,9) ad una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / pozzetto in piastre da 6 pozzetti rivestiti con 0,1% di gelatina. Assicurarsi che le cellule sono attaccati alla piastra prima di procedere con l'infezione virale.
10. Aggiungere 400 microlitri filtrato, freshly prodotto surnatante virale o aliquote congelate di ogni piatto sei bene durante la notte (mantenere 2 pozzi come controlli).
11. Cambiare medio alimentando cellule con 2,5 ml / pozzetto di mezzi freschi muscolare (4: 1 di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e Medium 199 supplementato con siero fetale bovino 15%; 0,02 M tampone HEPES, 1,4 mg / L di vitamina B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / L desametasone, 2.5 mg / l il fattore di crescita degli epatociti e / L fibroblasti fattore di crescita di base 10 mg). Eliminare i media e pipette contenenti le particelle virali in un contenitore di candeggina. Lasciare cellule nello stesso mezzo per 3 giorni per recuperare da infezione, poi trattare per la selezione utilizzando 400 mg / ml di neomicina (infezione CDK4) o 300 mg / ml igromicina (infezione hTERT).
12. Mantenere le cellule sotto selezione di droga fino a quando le cellule della matrice piatto di controllo (1-2 settimane).
13. Passaggio cellule prima che diventino confluenti (60-80% di confluenza, utilizzando 0,05% tripsina EDTA), anche durante la selectisul periodo. Cellule replate 10 centimetri in più piatti con media mioblasti fresca (come descritto in 2.11) integrati con il farmaco di selezione. Mantenere celle selezionate immortalizzate come popolazione eterogenea clonare o per ottenere un background genetico completamente omogenea (stessa inserimento del transgene in ogni cellula).
14. Eseguire la selezione clonale utilizzando le seguenti operazioni:
    1. Seme le cellule a bassa densità (ad esempio da 300 a 500 cellule in 10 piatti cm) e mantenere per circa due settimane, fino a quando si formano piccole colonie (10-20 cellule).
    2. Rimuovere la maggior parte del mezzo, a questo punto, lasciando solo una sottile pellicola per impedire le cellule si secchi.
    3. Posizionare un anello di clonazione (con una estremità immersa in grasso per vuoto silicone) su ogni clone desiderato e aggiungere qualche goccia di tripsina / EDTA.
    4. Celle di raccolta una volta che diventano arrotondati aspirando attentamente le cellule con una punta 1 ml o una pipetta Pasteur e trasferirli al più piccolo disponibile pla pozzettite (96 o 48, 24 o 12 pozzetti).
    5. Espandere cloni come necessario per evitare confluenza locale.

Risultati

Figura 1 illustra alcuni dei passaggi chiave coinvolti nella dissociazione tessuti primaria: l'esatta quantità di tessuto è pesato in un piatto di coltura di tessuti petri sterile (Figura 1A, B). Il tessuto viene quindi macinato finemente usando bisturi sterile, fino ad ottenere uno slurry di tessuto (Figura 1C, D). Dopo l'aggiunta di enzimi digestivi, il muscolo principale dissociazione del tessuto avviene normalmente tramite digestione enzimatica entro 45-90...

Discussione

Le cellule come una risorsa utile

L'isolamento e la cultura delle popolazioni di cellule miogeniche è estremamente utile quando si stabilisce fenotipi di malattia o in modelli in vitro di malattia. La procedura di isolamento delle cellule miogeniche qui descritto consente l'isolamento di mioblasti e fibroblasti da campioni del muscolo scheletrico, che possono poi essere propagate, differenziati, o immediatamente analizzati. La struttura e la funzione dei mioblasti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010