Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

Zusammenfassung

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Zusammenfassung

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Einleitung

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

Protokoll

HINWEIS: Protokolle für die Sammlung von menschlichem Gewebe muss überprüft und von der Institutional IRB Ausschuss genehmigt werden. Sammlung von verworfen, de-identifizierte menschliche Gewebe wurde von der Boston-Kinderklinik und Brigham and Womens Hospital IRB Ausschüsse zugelassen. Die nachfolgend beschriebenen Methoden zur Isolierung von myogenen Zellen aus deidentifiziert angewendet wurde, verworfen Gewebe. Die beschriebenen Verfahren sind für Gewebe von Patienten zugestimmt Material gesammelt.

1. Zellisolation

1. Die Dissoziation von Muskelbiopsie und Reinigung von myogenen Zellen
   1. Pre-wiegen 10 cm Gewebekulturplatte in einer Gewebekultur Biosicherheit Haube und dann erneut wiegen die Platte, die die Muskelbiopsie, die Menge an Gewebe zu berechnen, getrennt werden.
   2. Mit einer sterilen Skalpellen, Hackfleisch Muskelgewebe fein und fügen Sie ein paar Tropfen sterile 1x HBSS, um Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern.
   3. Jeweils Di 3,5 mlspase II und Collagenase D pro Gramm Muskelgewebe verdaut werden. Pipettieren des zerkleinerten Gewebes und Enzymlösung durch ein steriles 25 ml-Pipette ein paar mal. Inkubieren der Platte in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 15 min und zu verdauen Gewebe, bis die Aufschlämmung leicht wenn eine sterile 5 ml-Pipette durchläuft.
      HINWEIS: Gewebedissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Bitte lesen Sie den Abschnitt 'Repräsentative Ergebnisse "für weitere Informationen.
   4. Hinzufügen von 2 Volumina sterilem Wachstumsmedium dissoziierten Gewebe, filtriert über ein 100 & mgr; m Zellsieb über eine 50 ml konischen Röhrchen und Pellets Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) bei Raumtemperatur. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   5. Das Pellet in 1 Volumen sterilen Wachstumsmedium und fügen 7 Volumen der roten Blutkörperchen Lyselösung. Filtern der Lösung durch ein 40 & mgr; m Zellsieb dann pelle ter Zellen für 10 min bei 329 × g, Raumtemperatur.
   6. Zählen der Zellen in einem Hämozytometer und Resuspendieren der Zellen in HBSS 1x 0,5% BSA in einer Konzentration von 1 x 10 ⁶ Zellen / 100 & mgr; l. Beiseite ~ 250.000 Zellen in einem einzigen Rohr, das als negative (ungefärbten) Steuerung verwendet wird. Beiseite zusätzliche einfarbigen gefärbt Kontrollröhrchen für Propidiumiodid und CD56, die für die ordnungsgemäße Anspritzung von CD56-positiven Zellen durch FACS-Sortierung erforderlich. Bitte beachten Sie die Sortierung Handbücher Zelle oder wenden Sie sich mit FACS-Sortierung Core Facility Experten zu entsprechenden Kontrollen zu gewährleisten enthalten sind.
   7. Färben sich die Zellen mit 5 & mgr; / 10 ⁶ Zellen von anti CD56 Antikörper sortiert werden. Alle Proben (einschließlich Kontrollen) auf Eis inkubieren für 30 Minuten.
   8. Waschproben in 10 ml 1x HBSS und Pellet-Zellen für 10 min bei 329 × g (~ 1100 rpm) in einer Kühlzentrifuge bei 4 ° C Temperatur.
   9. Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml zu der Probe zu sein sorten für den Ausschluss von toten Zellen. Reinige myogenen CD56-positiven Zellen aus nicht-myogenen Zellen mit Hilfe der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer.
2. Die Dissoziation von Hautbiopsie
   HINWEIS: Die dermale Fibroblasten aus einer Hautstanze von Patienten isoliert werden, wenn Muskelbiopsien sind nicht verfügbar. Hautfibroblasten als Biomaterial für viele Studien, einschließlich der Transduktion mit MyoD zu myogenen Zellen zu erzeugen genutzt werden. Zusätzlich können dermale Fibroblasten verwendet, um iPS-Zellen, die in verschiedenen Zelltypen, für die weitere Untersuchung unterschieden werden können erzeugen.
   1. Transportieren Sie die Hautbiopsie an das Labor in Transportmedium. Sobald die Probe empfangen wird, führen die primäre Kultur so schnell wie möglich. Wenn die primäre Kultur nicht am selben Tag ermittelt werden, speichern die Probe bei Raumtemperatur über Nacht.
   2. Übertragen der Hautprobe auf eine sterile 35 mm Petrischale in der Sterilbank.
   3. Spülen Sie die Hautbiopsie in einer Petrischale mit steriler 1x PBS, Blut und Trümmer zu entfernen. Entfernen Sie das Fettgewebe mit einem sterilen Skalpell.
   4. 2 ml Kollagenase-Lösung und zerkleinern das Gewebe mit Skalpell, Inkubation bei 37 ° C für 45 min bis 1 h, je nach der Größe des Gewebes.
   5. Übertragen Sie die verdaute Gewebe zu einem 15 ml konischen Röhrchen, spülen Sie die Petrischale mit 2 ml Fibroblasten-Kulturmedium zweimal, und sammeln Sie das Medium in der gleichen Röhre.
   6. Pelle Zellen bei 200 g für 5 min bei Raumtemperatur.
   7. Überstand verwerfen und waschen das Pellet mit 3 ml Fibroblastenmedium, um die Kollagenase wieder zu entfernen, dann Pellet-Zellen. Bitte beachten Sie die Werkstoff-Tabelle für Medienzusammensetzung beziehen.
   8. Wiederholen Sie den Schritt 1.2.7 noch einmal.
   9. Re-suspend das Pellet in 5 ml Medium Fibroblasten und Plattenzellen auf einen T25 sterile Gewebekulturflasche. Der Kolben wird bei 37 ° C mit 5% CO ₂ inkubiert.
   10. Bewerten Sie die Kultur für Fibroblasten-Anhaftung und das Wachstum in den nächsten 1-3 Tagen.
       Hinweis: Einige kleine Gewebestücke können auch auf den Teller legen und Fibroblasten Migration von diesen Gewebestücken.
   11. Aufrechterhaltung der Kultur unter den gleichen Bedingungen bis Fibroblasten auf etwa 80% Konfluenz gezüchtet.
   12. Sammeln Fibroblasten durch Trypsinisierung und Transfer auf frische Kulturflaschen für weitere Expansion. Führen Trypsinierung entfernt, indem die Kulturen 3-mal in 1x PBS frei von Ca ⁺⁺ und Mg ^++. Hinzufügen Trypsin-EDTA (siehe Materialien Table) zu den Zellen (2 ml / T25-Kolben) für 2 min bei 37 ° C.
   13. Split abgelösten Zellen in zusätzliche Kolben. Wenn einige Gewebestücke bleiben an der ursprünglichen T25-Kolben angebracht ist, mit 5 ml frischem Kulturmedium, um diesen Kolben und Fibroblasten erfolgt kontinuierlich zu migrieren.
       HINWEIS: Der expandierte Fibroblastenkultur setzt sich wie P1 eingefroren und in flüssigem Stickstoff für zukünftige Experimente gelagert werden.

2. Immortalisierung von myogenen Zellen

1. Platte 5 Millionen Phoenix ecotropen Verpackungszellen (PE) über Nacht in einer 10 cm sterile Gewebekulturplatte in DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, mit 10% Kälberserum ergänzt.
2. Futterzellen 30 min vor der Transfektion mit 5 ml frischem Medium mit 10 mM Koffein ergänzt.
3. Homogenisieren einer Mischung von 2 ug Plasmid-DNA aus einem Midi prep (CDK4 oder hTERT-Plasmid) und Polyjet und Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min, wie vom Hersteller empfohlen.
4. Fügen Sie das Plasmid / PolyJet Mischung auf die PE-Zellen über Nacht.
5. Feed-Zellen mit frischem Medium (DMEM und Medium 199 in einem Verhältnis von 4: 1, das mit 10% Kälberserum). Zwölf Stunden später sammeln das virushaltige Überstand und filtern sie durch ein 0,45 um Porengrße-Filter.
6. Verwenden von 1 ml Überstand gesammelt, über Nacht amphotropen Verpackungszelllinie PA317 ⁵ infizieren und zu einem stabilen Virus-produzierenden Zelllinie nach der Selektion mit entweder 0,5 mg / ml Neomycin (G418) für CDK4 oder 0,5 mg / ml Hygromycin hTERT.
7. Bereiten Sie Arbeits viralen Überständen durch Wachstum der stabilen Verpackungszellen in der Nähe der Konfluenz, dann die Ernte der Überstand jeden Morgen, Abend und Morgen für drei Ernten.
8. Filtern Sie die Virusüberständen und entweder direkt verwenden oder teilen sie in 1 ml Aliquots und bei -80 ° C für die spätere Verwendung. Beachten Sie, dass Virusüberstand verliert 50% Infektionseffizienz bei jedem Frost-Tau. Denken Sie daran, die Bleichmittel waschen vor dem Wegwerfen alles, was der Viruspartikel berührt hat.
   HINWEIS: Die stabile PA317 Virus-produzierende Zelllinie kann eingefroren und bei -150 ° C für die dauerhafte Speicherung beibehalten werden (Einfriermedium 10% DMSO, 90% Serum).
9. Platte FACS-gereinigte myogenen Zellen in einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit 0,1% Gelatine beschichtet (in Schritten 1.1-1.9 beschrieben). Sicherzustellen, dass die Zellen an der Platte vor der Virusinfektion hend angebracht.
10. Fügen Sie 400 ul gefiltert, freshly produzierte Virusüberstand oder gefrorenen Aliquots zu jedem Sechs-Well-Platte über Nacht (halten 2 Brunnen als Kontrollen).
11. Ändern Medium durch Zuführen Zellen mit 2,5 ml / Vertiefung frisches Muskelmedien (4: 1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und Medium 199 mit 15% fötalem Rinderserum, 0,02 M HEPES-Puffer, 1,4 mg / l Vitamin B12; 0,03 mg / L ZnSO4, 0,055 mg / l Dexamethason, 2,5 ug / l Hepatozytenwachstumsfaktor und 10 ug / l basic fibroblast growth factor). Entsorgen Sie die Medien und Pipetten, die die Viruspartikel in einem Bleichbehälter. Lassen Zellen im gleichen Medium für 3 Tage, um vor Infektionen zu erholen, dann behandeln Sie zur Auswahl entweder mit 400 ug / ml Neomycin (CDK4 Infektion) oder 300 ug / ml Hygromycin (hTERT-Infektion).
12. Pflegen Zellen unter Medikamentenauswahl, bis die Zellen in der Kontrollschale Matrize (1-2 Wochen).
13. Passage-Zellen bevor sie konfluent werden (60-80% Konfluenz, unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA), selbst während der selectinach Zeitraum. Ausstrich Zellen in mehreren 10cm Gerichte mit frischen Myoblasten-Medium (wie in 2.11 beschrieben) mit der Auswahl Medikament ergänzt. Pflegen immortalisierten ausgewählte Zellen als heterogene Population oder klonieren, um eine vollständig homogene genetischen Hintergrund (das gleiche Insertion des Transgens in jeder Zelle) zu erhalten.
14. Führen klonalen Selektion mit den folgenden Schritten:
    1. Samen der Zellen bei niedriger Dichte (zB 300 bis 500 Zellen in 10 cm-Schalen) und halten sie für etwa zwei Wochen, bis kleine Kolonien werden (10-20 Zellen) gebildet.
    2. Verringert sich die Medium an dieser Stelle, so dass nur eine dünne Folie, die Zellen nicht austrocknen.
    3. Legen Sie ein Klonen Ring (mit einem Ende eingetaucht in Silikonvakuumfett) über jeden gewünschten Klon und ein paar Tropfen von Trypsin / EDTA.
    4. Ernten Sie die Zellen, wenn sie geworden durch vorsichtiges Absaugen der Zellen unter Verwendung einer 1 ml Spitze oder eine Pasteur-Pipette und ihre Übertragung auf dem kleinsten verfügbaren Multiwell-pla abgerundette (96 oder 48, 24 oder 12-Well-Platten).
    5. Erweitern Klone wie notwendig, um lokale Konfluenz zu verhindern.

Ergebnisse

1 zeigt einige der Hauptschritte in der Primär Gewebedissoziation beteiligt: ​​die genaue Menge an Gewebe in einem sterilen Gewebekulturpetrischale eingewogen (1A, B). Das Gewebe wird dann fein zerkleinert unter Verwendung von sterilen Skalpellen, bis eine Gewebe Aufschlämmung erhalten (1C, D). Nach der Zugabe der Verdauungsenzyme, primäre Muskelgewebe Dissoziation wird üblicherweise durch enzymatische Verdauung innerhalb 45-90 min erreicht wird. Das Fortschreit...

Diskussion

Cells als Nützliche Ressource

Die Isolierung und Kultivierung von myogene Zellpopulationen ist äußerst nützlich bei der Festlegung Krankheitsphänotypen oder in vitro-Modelle von Erkrankungen. Die hier beschriebene myogenen Zellisolierungsverfahren erlaubt die Isolierung von Myoblasten und Fibroblasten aus der Skelettmuskulatur Proben, die dann weitergegeben werden können, unterschieden, oder sofort analysiert. Myoblasten Struktur und Funktion kann durch mikroskopische Untersuc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010