Выделение и Иммортализация пациента, полученных клеточных линий мышечной биопсии для моделирования заболеваний

Резюме

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Аннотация

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Введение

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для сбора ткани человека должны быть рассмотрены и одобрены комиссией Институциональная IRB. Коллекция отбрасываются, обезличенной человеческой ткани был одобрен больницы Бостона детей и Brigham и женской больницы IRB комитетов. Способы, описанные ниже, были применены для выделения клеток из миогенными де-определены, отбрасываются ткани. Описанные методы применимы к ткани, собранной из согласие материала пациента.

1. Выделение клеток

1. Диссоциация мышечной биопсии и очистки миогенных клеток
   1. Предварительно весить 10 см планшета для культуры ткани в культуре ткани капот биологической безопасности, а затем повторно взвешивают пластину, содержащую мышечной биопсии, чтобы рассчитать количество ткани, чтобы быть отделены.
   2. Использование стерильных скальпелей, пропустить через мясорубку мышечной ткани мелко и добавить несколько капель стерильного 1x HBSS, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
   3. Добавить 3,5 мл каждого из диКосмических II и коллагеназы D на грамм мышечной ткани переваривается. Внесите фарш ткани и ферментного раствора через стерильный 25 мл пипетки несколько раз. Инкубируют планшет в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 15 мин и переварить ткань до тех пор, пока суспензия легко проходит через стерильный 5 мл пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ткани диссоциации обычно достигается путем ферментативного расщепления в 45-90 мин. Пожалуйста, обратитесь к разделу "Представитель Результаты" для получения дополнительной информации.
   4. Добавить 2 объемами стерильной среды роста на диссоциированного ткани, фильтр через 100 мкм сито клеток свыше 50 мл коническую трубку и гранул клеток в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту), комнатной температуры. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
   5. Ресуспендируют осадок в 1 объеме стерильной среды роста и добавить 7 томов красный раствор лизиса клеток крови. Фильтр раствора через клеточный фильтр 40 мкм, затем гранул тон клеток в течение 10 мин при 329 мкг, комнатной температуры.
   6. Количество клеток в гемоцитометра и ресуспендирования клеток в 1x HBSS 0,5% BSA в концентрации 1 × 10 ⁶ клеток / 100 мкл. Установите в сторону ~ 250000 клеток в одной пробирке, которые будут использоваться в качестве (неокрашенной) управления отрицательным. Отложите дополнительные одноцветных окрашенных управления трубы для пропидийиодидом и для CD56, которые необходимы для правильного стробирования CD56-положительных клеток по FACS сортировки. Пожалуйста, обратитесь к сортировки клеток руководства или проконсультируйтесь с FACS сортировки экспертов основной комплекс для обеспечения надлежащего контроля включены.
   7. Пятно клетки должны быть отсортированы с 5 мкл / 10 ⁶ клеток анти CD56 антител. Выдержите все образцы (в том числе управления) на льду в течение 30 мин.
   8. Образцы стирка в 10 мл 1х HBSS и гранул клетки в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту) в охлаждаемой центрифуге, 4 ° C температуре.
   9. Добавить пропидийиодидом в конечной концентрации 1 мкг / мл в образце, чтобы быть SorТед для исключения мертвых клеток. Очищают миогенные CD56-положительных клеток от не-миогенных клеток с использованием флуоресцентного активирована сортировщик клеток.
2. Диссоциация биопсии кожи
   Примечание: дермальных фибробластов могут быть выделены из пуансона кожи от пациентов при биопсии мышц отсутствуют. Дермальных фибробластов могут быть использованы в качестве биоматериала в течение многих исследований, в том числе трансдукции с MyoD генерировать миогенные клеток. Кроме того, кожные фибробласты могут быть использованы для создания плюрипотентных клеток, которые могут быть дифференцированы в различные типы клеток для дальнейшего исследования.
   1. Транспорт биопсии кожи в лабораторию в транспортной среде. После того, как образец будет получена, выполнить первичную культуру, как можно скорее. Если основной культуры не может быть установлена ​​в тот же день, хранить образцы при комнатной температуре в течение ночи.
   2. Передача биопсии кожи в стерильную 35 мм чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком.
   3. Промойте биопсию кожи в чашке Петри со стерильной 1х PBS, чтобы удалить кровь и грязь. Удалить жировой ткани стерильным скальпелем.
   4. Добавить 2 мл раствора коллагеназы и фарш ткани с скальпелем, инкубировать при 37 ° С в течение 45 мин до 1 ч, в зависимости от размера ткани.
   5. Передача переваренной ткани на 15 мл коническую трубку, промыть в чашку Петри с 2 мл питательной среды фибробластов в два раза, и собирать среды в той же трубе.
   6. Гранул клетки при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   7. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 3 мл среды фибробластов, чтобы удалить коллагеназы, затем гранул клетки снова. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
   8. Повторите шаг 1.2.7 еще один раз.
   9. Повторное приостановить осадок в 5 мл фибробластов средних и пластинчатых клеток на Т25 стерильного тканевой культуральной колбы. Инкубируйте колбы при 37 ° C с 5% CO _2.
   10. Оценить культуры для крепления фибробластов и рост в течение ближайших 1-3 дней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мелкие кусочки ткани также может приложить к плите и фибробласты мигрируют из этих тканей штук.
   11. Поддержание культуры в тех же условиях до тех пор, пока фибробласты выращивали до приблизительно 80% слияния.
   12. Сбор фибробласты трипсинизацией и передать на свежие культуры колбах для дополнительного расширения. Выполните трипсинизации промывкой культур 3 раза в 1X PBS бесплатно Са ⁺⁺ и Mg ^++. Добавить трипсин-ЭДТА (см материалы таблица) к клеткам (2 мл / Т25 колбы) в течение 2 мин при 37 ° С.
   13. Сплит отдельные клетки в дополнительные колбы. Если некоторые кусочки ткани остаются прикрепленными к оригинальным колбы Т25, добавить 5 мл свежей культуральной средой в эту колбу и больше фибробласты мигрируют постоянно.
       Примечание: расширен культуре фибробластов могут быть заморожены вниз, как Р1 и хранили в жидком азоте для будущих экспериментов.

2. Иммортализация миогенных клеток

1. Пластина 5000000 Феникс экотропного упаковки клетки (PE) в течение ночи в 10 см стерильной планшет для тканевых культур в среде DMEM и среды 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 10% сыворотки теленка.
2. Кормовые клетки 30 мин до трансфекции с 5 мл свежей средой с добавлением 10 мМ кофеина.
3. Однородный смесь 2 мкг плазмидной ДНК из миди преп (CDK4 или hTERT плазмиды) и PolyJet и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, в соответствии с рекомендациями производителя.
4. Добавить плазмиды / POLYJET смесь на PE клеток ночь.
5. Поток клетки свежей средой (DMEM, и среда 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 10% сыворотки теленка). Двенадцать часов спустя, собрать вирус, содержащий супернатант и фильтровать ее через фильтр размер 0,45 мкм пор.
6. Использование 1 мл собранной супернатант заразить в течение ночи PA317 амфотропный упаковка клеточной линии ⁵ и получить стабильный вируса-продуцирующих клеток линии после выбора либо с 0,5 мг / мл неомицина (G418) для CDK4 или 0,5 мг / мл гигромицину для hTERT.
7. Подготовка рабочих вирусные супернатанты путем выращивания устойчивых упаковочных клеток почти до слияния, затем уборки супернатант каждое утро и вечером, и утром в течение трех урожаев.
8. Фильтр вирусные супернатанты и либо сразу использовать или разделить их на 1 мл аликвоты и хранят при -80 ° С для последующего использования. Обратите внимание, что вирусная супернатант теряет 50% эффективности инфекции с каждым замораживания-оттаивания. Помните, чтобы отбелить стирка, прежде чем выбросить все, что коснулся вирусные частицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: стабильная PA317 вирус-продуцирующих клеточная линия может быть заморожен и выдерживают при -150 ° C для постоянного хранения (замораживание среды составляет 10% ДМСО; 90% сыворотки).
9. Пластина FACS-очищали миогенные клетки (как описано в шагах 1,1-1,9) при плотности 5 х 10 ⁴ клеток / лунку в 6-луночных планшетах, покрытых 0,1% желатином. Убедитесь, что клетки прикреплены к пластине, прежде чем приступить к вирусной инфекции.
10. Добавить 400 мкл фильтруется, Freshly производится вирусный супернатант или замороженные аликвоты для каждого шесть-луночного планшета в течение ночи (держать 2 скважин в качестве контроля).
11. Изменение среды путем подачи клетки с 2,5 мл / лунку свежим мышечной информации (4: 1, модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM), и среды 199, дополненной 15% фетальной бычьей сыворотки; 0,02 М HEPES буфера, 1,4 мг / л витамина В12; 0,03 мг / л ZnSO4, 0,055 мг / л дексаметазона, 2,5 мкг / л фактора роста гепатоцитов и 10 мкг / л Основной фактор роста фибробластов). Откажитесь от средств массовой информации и пипетки, содержащие вирусные частицы в хлорной тары. Оставьте клетки в той же среде в течение 3 дней, чтобы восстановиться после инфекции, затем обрабатывают для выбора с использованием либо 400 мкг / мл неомицина (CDK4 инфекции) или 300 мкг / мл гигромицина (hTERT инфекции).
12. Поддерживать клетки под выбора препарата до клеток в контрольной блюдо умереть (1-2 недели).
13. Прохождение клетки, прежде чем они становятся сливной (60-80% слияния, использование 0,05% трипсина ЭДТА), даже во время Selectiна период. Replate клетки в несколько 10см блюд со свежими миобластов среды (как описано в 2,11), с добавлением выбора препарата. Поддержание увековечили выбранные ячейки представляют собой гетерогенную популяцию или клонировать, чтобы получить полностью однородную генетический фон (те же вставки трансгена в каждой клетке).
14. Выполните клонов выбор, используя следующие шаги:
    1. Семенной клетки с низкой плотностью (например, от 300 до 500 клеток в 10 см чашки) и поддерживать их в течение приблизительно двух недель, пока небольшие колонии не образуются (10-20 клеток).
    2. Удалить большинство среде в этой точке, оставляя лишь тонкую пленку, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
    3. Поставьте клонирования кольцо (с одним концом, смоченной в силиконовой вакуумной смазки) по каждой нужной клона и добавить несколько капель трипсина / ЭДТА.
    4. Урожай клетки, когда они округляется тщательно аспирации клеток с использованием наконечника 1 мл или пипетки Пастера и передачи их наименьшим доступным многоямного плаTE (96 или 48, 24 или 12-луночные планшеты).
    5. Expand клонов, сколько необходимо для предотвращения местного слияния.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует некоторые из основных шагов при диссоциации первичной ткани: Точное количество ткани, взвешивают в стерильной культуре ткани чашках Петри (1А, Б). Затем ткань тонко измельченного с помощью стерильных скальпелей, пока ткань суспензию получают

Обсуждение

Клетки как полезный ресурс

Выделение и культивирование миогенных клеточных популяций является чрезвычайно полезным при установлении заболевания фенотипа или в пробирке моделей болезни. Миогенного процедура изолятор описано здесь, дает возможность изолировать ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010