בידוד והנצחה של שורות תאים שמקורם בחולה מביופסיה של שריר למחל דוגמנות

Summary

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Abstract

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Introduction

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

Protocol

הערה: פרוטוקולים לאוסף של רקמות אדם צריכים להיות נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית IRB. אוסף של רקמה אנושית שהושלכה, מזוהה de אושר על ידי בית החולים לילדים בבוסטון וועדות IRB Brigham and בית החולים לנשים. השיטות שתוארו להלן יושמו בבידוד של תאי myogenic מדה-מזוהה, שהושלך רקמה. השיטות שתוארו חלות על רקמה שנאספו מחומר מטופל הסכים.

1. בידוד תא

1. ניתוק של ביופסיה של שריר וטיהור של תאי myogenic
   1. טרום לשקול צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים במנדף בטיחות ביולוגי בתרבית רקמה, ולאחר מכן לשקול מחדש את הצלחת המכילה את הביופסיה של השריר כדי לחשב את כמות הרקמה שניתק.
   2. באמצעות אזמלים סטריליים, רקמת שריר בשר טחון דק ולהוסיף כמה טיפות של סטרילית 1x HBSS כדי למנוע רקמות מהתייבשות.
   3. להוסיף 3.5 מיליליטר כל אחת מdispase השני וcollagenase D לגרם של רקמת שריר להתעכל. פיפטה רקמות טחונות ופתרון אנזים באמצעות פיפטה 25 מיליליטר סטרילי כמה פעמים. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ במשך 15 דקות ולעכל רקמה עד slurry עובר בקלות אם כי טפטפת מיליליטר סטרילי 5.
      הערה: ניתוק רקמות מושגים בדרך כלל על ידי עיכול אנזימטי בתוך 45-90 דקות. עיין בסעיף 'נציגי התוצאות "לפרטים נוספים.
   4. הוסף 2 כרכים של מדיום גידול סטריליים לרקמה ניתק, מסנן דרך מסננת 100 מיקרומטר תא מעל 50 מיליליטר תאי צינור וגלול חרוטי במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד), בטמפרטורת חדר. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
   5. Resuspend גלולה בנפח של 1 מדיום גידול סטרילי ולהוסיף 7 כרכים פתרון תמוגה תא דם אדום. סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40 מיקרומטר, אז גלולה tהוא תאים במשך 10 דקות ב 329 XG, בטמפרטורת חדר.
   6. ספירת התאים בhemocytometer וresuspend תאי BSA 0.5% 1x HBSS בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / μl 100. מניח בצד ~ 250,000 תאים בצינור אחד שישמשו כשלילית שליטה (בלא כתם). הגדר צינורות צד נוספים חד-צבע מוכתם שליטה ליודיד propidium ולCD56, הנדרשים לgating התקין של תאים חיוביים CD56 על ידי מיון FACS. אנא עיין בתא מדריכים למיון או להתייעץ עם FACS מיון מומחי מתקן ליבה כדי להבטיח בקרה נאותה כלולים.
   7. כתם התאים להיות מסודרים עם 5μl / 10 ⁶ תאים של נוגדן אנטי CD56. דגירה כל הדגימות (כולל בקרות) על קרח למשך 30 דקות.
   8. לשטוף דגימות ב 10 מיליליטר 1x HBSS ותאים גלולה במשך 10 דקות ב 329 XG (~ 1,100 סל"ד) בצנטריפוגה בקירור, 4 ° C טמפרטורה.
   9. להוסיף יודיד propidium בריכוז סופי של 1μg / מיליליטר המדגם להיות sorטד להרחקה של תאים מתים. לטהר תאים חיוביים myogenic CD56 מהתאים שאינם myogenic באמצעות סדרן תא הקרינה הופעלה.
2. ניתוק של ביופסיה של עור
   יכול להיות מבודד fibroblasts Dermal מאגרוף עור מחולים כאשר ביופסיות שריר אינן זמינות: הערה. fibroblasts עורי יכול לשמש כחומר ביולוגי למחקרים רבים, כוללים התמרה עם Myod לייצר תאי myogenic. בנוסף, ניתן להשתמש fibroblasts עורי ליצירת תאי iPS, אשר יכול להיות מובחן לסוגי תאים שונים למחקר נוסף.
   1. להעביר את הביופסיה של העור למעבדה במדיום תחבורה. לאחר המדגם הוא קיבל, לבצע את התרבות העיקרית בהקדם האפשרי. אם התרבות העיקרית לא ניתן לקבוע באותו היום, לאחסן המדגם בטמפרטורת חדר למשך לילה.
   2. העבר את הביופסיה של העור לצלחת פטרי 35 מ"מ סטרילי בזרימה למינרית.
   3. יש לשטוף את הביופסיה של העור בצלחת פטרי עם 1 סטריליx PBS להסיר דם ופסולת. הסר את רקמת השומן עם אזמל סטרילי.
   4. הוסף פתרון collagenase 2 מ"ל ולקצץ את הרקמה עם אזמל, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לשעה 1, תלוי בגודל של הרקמה.
   5. העברת הרקמה מתעכל לצינור חרוטי 15 מיליליטר, לשטוף את צלחת פטרי עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות פיברובלסטים פעמיים, ולאסוף את המדיום באותו הצינור.
   6. גלולה תאים ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
   7. בטל supernatant ולשטוף את הכדור עם 3 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים להסיר collagenase, אז תאי גלולה שוב. אנא עיין בטבלת חומרים להרכב תקשורת.
   8. חזור על השלב 1.2.7 עוד פעם אחת.
   9. להשעות מחדש גלולה בתאים בינוניים פיברובלסטים וצלחת 5 מיליליטר על בקבוק תרבות רקמת T25 סטרילי. דגירה הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   10. להעריך את התרבות לקובץ מצורף פיברובלסטים וצמיחה מעל 1-3 הימים הקרובים.
       הערה: חלק פיסות רקמה קטנה עשויות גם לצרף הצלחת וfibroblasts להעביר את חתיכות רקמה אלה.
   11. לשמור על התרבות באותם תנאים עד fibroblasts גדלים למפגש כ -80%.
   12. לאסוף fibroblasts ידי trypsinization ולהעביר על גבי צלוחיות תרבות טריות להרחבה נוספת. בצע trypsinization ידי שטיפת התרבויות 3 פעמים ב1x PBS ללא Ca ⁺⁺ Mg ^++. להוסיף טריפסין-EDTA (ראו לוח חומרים) לתאים (2ml / בקבוק T25) למשך 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   13. פיצול תאים מנותקים לתוך צלוחיות נוספות. אם כמה חתיכות רקמה נשארות צמודות לצלוחיות T25 המקוריות, להוסיף 5 מיליליטר מדיום תרבות הטרי לבקבוק זה ועוד fibroblasts יעבור את הרף.
       הערה: תרבות פיברובלסטים המורחבת אפשר להקפיא למטה כמו P1 ומאוחסנות בחנקן נוזלי לניסויים עתידיים.

2. הנצחה של תאי myogenic

1. פלייט תאי 5 מיליון הפניקס Ecotropic אריזה (PE) לילה בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים סטרילי בDMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 10% עגל בסרום.
2. תאי Feed 30 דקות לפני transfection עם 5 מיליליטר של תקשורת טרי בתוספת קפאין 10 מ"מ.
3. Homogenize תערובת של 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד מהכנת midi (פלסמיד cdk4 או hTERT) וPolyjet ודגירה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, כפי שהומלץ על ידי היצרן.
4. מוסיף את תערובת פלסמיד / Polyjet לתאי PE הלילה.
5. תאים להאכיל עם מדיום חדש (DMEM ובינוני 199 על יחס של 4: 1, בתוספת 10% עגל בסרום). שתים עשרה שעות מאוחר יותר, לאסוף את supernatant המכיל וירוסים ולסנן אותה דרך מסנן גודל 0.45 מיקרומטר נקבובית.
6. השתמש 1 מיליליטר של supernatant נאסף להדביק לילה PA317 קו תא אריזת amphotropic ⁵ ולקבל שורת תאים לייצר וירוס יציב לאחר בחירה עם או 0.5 מ"ג / מיליליטר נאומיצין (G418) לcdk4 או 0.5 מ"ג / מיליליטר hygromycin לhTERT.
7. הכן עובד supernatants ויראלי על ידי גידול תאי אריזה היציב לconfluency הקרוב, ולאחר מכן קציר supernatant בכל בוקר, ערב ובוקר לשלושה יבולים.
8. סנן את supernatants ויראלי ובמישרין או להשתמש לחלק אותם ל1 aliquots מיליליטר ולאחסן ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. שים לב שsupernatant ויראלי מאבד 50% יעילות הדבקה בכל להקפיא להפשיר. זכור כדי להלבין שטיפה לפני השלכת כל מה שנגע בחלקיקים הנגיפיים.
   הערה: שורת התאים-ייצור וירוס PA317 היציבה יכולה להיות קפוא ונשמרה ב-150 מעלות צלזיוס במשך אחסון קבוע (הקפאה בינונית היא DMSO 10%; סרום 90%).
9. מטוהר FACS צלחת תאי myogenic (מתואר בצעדים 1.1-1.9) בצפיפות של 5 x 10 ⁴ תאים / גם ב6-גם צלחות מצופות ג'לטין 0.1%. ודא כי תאים המחוברים לצלחת לפני שימשיכו עם זיהום ויראלי.
10. להוסיף 400 μl מסונן, freshly מיוצר supernatant הנגיפי או aliquots הקפוא לכל צלחת שש היטב לילה (לשמור 2 בארות כפקדים).
11. שנה בינונית על ידי האכלת תאים עם 2.5 מיליליטר / גם של תקשורת טרי שריר (4: 1 בינוני הנשר (DMEM) שונה Dulbecco ובינוני 199 בתוספת 15% בסרום שור עוברי; 0.02 M HEPES חיץ; ויטמין 1.4 מ"ג / L B12; 0.03 מ"ג / L ZnSO4, dexamethasone 0.055 מ"ג / L, גורם גדילת hepatocyte / l 2.5 מיקרוגרם וגורם גדילת 10 מיקרוגרם / L פיברובלסטים בסיסיים). מחק את התקשורת וטפטפות המכילה חלקיקים הנגיפיים במכל אקונומיקה. לצאת מתאים באותו בינוני במשך 3 ימים להתאושש מזיהום, אז להתייחס לבחירה או באמצעות 400 מיקרוגרם / מיליליטר נאומיצין (זיהום cdk4) או 300 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin (זיהום hTERT).
12. שמור על תאים תחת בחירת תרופה עד שהתאים במנה למות שליטה (1-2 שבועות).
13. תאי מעבר לפני שהן הופכות מחוברות (confluency 60-80%; באמצעות 0.05% טריפסין EDTA), גם בselectiבתקופה. תאי Replate במנות 10 ס"מ מרובים עם מדיום myoblast טרי (כמתואר ב2.11) בתוספת תרופת הבחירה. לשמור הנציחו תאים שנבחרו כאוכלוסייה הטרוגנית או לשכפל להשיג רקע הומוגנית לחלוטין גנטי (אותו החדרת transgene בכל תא).
14. לבצע בחירה משובט באמצעות השלבים הבאים:
    1. זרעי התאים בצפיפות נמוכה (למשל 300 עד 500 תאים 10 מנות סנטימטר) ולשמור אותם במשך כשבועיים, עד מושבות קטנות נוצרות (10-20 תאים).
    2. הסר ביותר של המדיום בשלב זה, ומשאיר רק סרט דק כדי למנוע את התאים מהתייבשות.
    3. מניחים טבעת שיבוט (עם קצה אחד טבול בשומן ואקום סיליקון) על כל שיבוט רצוי ולהוסיף כמה טיפות של טריפסין / EDTA.
    4. קציר תאים ברגע שהם הופכים מעוגלים ידי aspirating בזהירות את התאים באמצעות קצה מיליליטר 1 או pipet פסטר והעביר לPLA multiwell הכי הקטןte (96 או 48, 24 או 12 צלחות גם).
    5. להרחיב שיבוטים לפי צורך כדי למנוע confluency המקומי.

תוצאות

איור 1 מדגים כמה מהשלבים העיקריים המעורבים בניתוק הרקמה העיקרי: כמות הרקמה המדויקת נשקלה בצלחת פטרי תרבית רקמה סטריליים (איור 1 א ', ב'). הרקמה אז דק טחון באמצעות אזמלים סטריליים, עד slurry רקמה מתקבל (איור 1 ג, ד). בעקבות תוספת של אנזימי העיכול...

Discussion

תאים כמשאב שימושי

הבידוד והתרבות של אוכלוסיות תאי myogenic הוא מאוד שימושי כאשר הקמת פנוטיפים מחלה או במודלים חוץ גופית של מחלה. הליך בידוד תא myogenic המתואר כאן מאפשר הבידוד של myoblasts ופיברובלסטים מדגימות שרירי שלד, אז מה שיכול להי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010