病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

要約

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

要約

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient’s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

概要

Molecular diagnostics has dramatically evolved in the past 20 years. Genomic DNA is now routinely isolated from sputum or cheek swab, while in the past it required a blood draw. With the current fast turnaround time and ease of gene sequencing, many disease mutations are routinely identified with no need of additional testing. In the case of muscle disease diagnostics, identification of dozens of new genes in the past decade responsible for either muscular dystrophy or myopathy have dramatically changed the ways these diseases are diagnosed ^1,2. Currently, there are dozens of genes that have been identified as causes of muscular dystrophy and congenital myopathy, although the mechanisms by which many of these genes produce disease remain unclear. In particular, rare diseases constitute a challenge due to the small size of the patient populations. For these cases, as well as for more common diseases, the generation of stable tools that facilitate studies on the mechanism of pathogenesis and screening of therapeutic drugs is highly desirable.

Despite dramatic progress in DNA diagnostics, muscle biopsies are still performed to establish the primary diagnosis in many patients in whom primary metabolic or muscle disease is suspected. When a muscle biopsy is necessary, it offers the opportunity for additional diagnostic and research tissue collection with minimal additional morbidity risk for the patient. As there are a number of uses for each tissue specimen, it is highly desirable to establish techniques for primary cell culture using surgical tissue that are straightforward, efficient, and require minimal amounts of tissue. Proper triage of muscle or skin biopsies is required to maximize isolation of primary cells from tissue and long-term storage of live material. Additionally, stem cell research and drug screening holds great promise for developing therapies for many diseases using cell-based assays ^3,4.

We herein describe methods for primary cell isolation from human muscle or skin biopsies. Additionally, we include a protocol for immortalization of myogenic cells, which is useful for generating large numbers of cells from an individual. These cells can be used for downstream applications, such as custom drug-screenings, which are otherwise unachievable with the overall low number of cells obtained from primary tissue.

プロトコル

注：ヒト組織の収集のためのプロトコルを見直し、制度IRB委員会によって承認されなければならない。廃棄された、デ同定されたヒト組織の収集は、ボストン小児病院とブリガム·アンド·ウィメンズ病院IRB委員会によって承認されています。以下に記載される方法は、非識別破棄組織からの筋原細胞の単離のために適用されている。記載された方法は同意患者材料から採取した組織にも適用可能である。

1.細胞の単離

1. 筋生検と筋原細胞の精製の解離
   1. 組織培養バイオセーフティーフード内で10cmの組織培養プレートを、予め計量し、解離される組織の量を計算するために筋生検を含む再度計量プレート。
   2. 細かく、ミンチの筋肉組織を無菌メスを使用し、乾燥から組織を防ぐために、滅菌1X HBSSを数滴を追加します。
   3. 3.5ミリリットルのジのそれぞれを追加します。のSPase IIおよび筋組織のグラムあたりのコラゲナーゼDを消化する。無菌の25mlピペットを通して数回に細分化した組織と酵素溶液をピペット。 15分間、5％CO _2、37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートし、スラリーを簡単に無菌の5mlのピペットも通過するまで組織を消化する。
      注：組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。詳細は、「代表的な結果」セクションを参照してください。
   4. 329 XG（〜1100 rpm）で、室温で10分間50ミリリットルの円錐管とペレットの細胞の上に100μmのセルストレーナーを通して解離した組織、フィルタに滅菌成長培地の2ボリュームを追加します。培地組成のための材料の表を参照してください。
   5. 滅菌増殖培地の1容積にペレットを再懸濁し、赤血球溶解液を7ボリュームを追加。 40μmのセルストレーナーを通して溶液をフィルタリングし、その後Tペレット329×gで、室温で10分間、彼は細胞。
   6. 血球計数器で細胞を数え、1×10 ⁶細胞/ 100μlの濃度で1X HBSS、0.5％BSAで細胞を懸濁します。ネガティブ（非染色）を対照として使用される単一の管に置い〜250,000細胞を設定します。脇FACS選別によりCD56陽性細胞の適切なゲーティングのために必要とされるヨウ化プロピジウムおよびCD56のための追加単色染色コントロール管を、設定してください。並べ替えマニュアルを細胞又は適切なコントロールを確実にするために中核施設の専門家をFACSソーティングが含まれていると相談を参照してください。
   7. 抗CD56抗体の5μlの/ 10 ⁶細胞でソートする細胞を染色する。氷上で30分間（対照を含む）すべてのサンプルをインキュベートする。
   8. 冷却遠心機中で329×gで（〜1100 rpm）で10分間、10ミリリットル1×HBSS、ペレット細胞における洗浄サンプル、4℃の温度。
   9. SORである試料には1μg/ mlの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加死細胞を排除するためのテッド。蛍光活性化セルソーターを使用して非筋原細胞から筋原CD56陽性細胞を精製する。
2. 皮膚生検の解離
   NOTE：筋肉生検を入手できない場合真皮線維芽細胞は、患者からの皮膚パンチから単離することができる。真皮線維芽細胞は、筋原細胞を生成するためのMyoDでの形質導入を含む多くの研究のための生体材料として使用することができます。さらに、真皮線維芽細胞は、さらなる研究のために種々の細胞型に分化させることができるiPS細胞を生成するために用いることができる。
   1. 輸送培地中の研究室に皮膚生検を輸送する。サンプルが受信されると、できるだけ早く初代培養を行う。初代培養は、同じ日に確立できない場合、一晩室温で試料を保管。
   2. 層流フード内で無菌の35mmのペトリ皿に皮膚生検を転送する。
   3. 無菌の1とペトリ皿に皮膚生検をすすぐX PBSを血液や破片を除去する。滅菌メスで脂肪組織を削除します。
   4. 2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加し、外科用メスで組織をミンチ、組織の大きさに応じて、1時間に45分間37℃でインキュベートする。
   5. 15mlのコニカルチューブに消化された組織を転送回線維芽細胞培養培地2mlでペトリ皿をすすぎ、そして同じチューブに培地を収集する。
   6. 室温で5分間、200×gで細胞をペレット。
   7. 上清を捨て、コラゲナーゼを除去するための線維芽細胞培地3mlでペレットを洗浄し、再び細胞をペレット。培地組成のための材料の表を参照してください。
   8. ステップ1.2.7 1より多くの時間を繰り返します。
   9. T25無菌組織培養フラスコ上に5ミリリットル線維芽細胞培地プレートの細胞ペレットを再懸濁する。 5％CO _2、37℃でフラスコをインキュベートする。
   10. 次の1〜3日間の線維芽細胞の付着と成長のための文化を評価します。
       注：一部の小規模な組織片を、プレートに取り付けることができ、線維芽細胞は、これらの組織片の外に移動する。
   11. 線維芽細胞が約80％コンフルエンスまで増殖させるまで、同様の条件下で培養を維持する。
   12. トリプシン処理により繊維芽細胞を収集し、追加の拡張のために新鮮な培養フラスコに移す。のCa ⁺⁺およびMg ⁺⁺を含まない培養液を1×PBSで3回洗浄することによりトリプシン処理を実行します。 37℃で2分間細胞（2ミリリットル/ T25フラスコ）にトリプシン-EDTAを（材料表を参照）を追加します。
   13. 追加のフラスコに剥離した細胞を分割。いくつかの組織片は、元のT25フラスコに取り付けたままにした場合、このフラスコに5ミリリットルの新鮮な培地を追加し、より多くの線維芽細胞は、継続的に行わ移行する。
       注：拡張され線維芽細胞培養は、P1として凍結し、および将来の実験のために液体窒素中で保存することができる。

筋原細胞の2不死

1. を一晩4の比率のDMEMと培地199 10cmの滅菌組織培養プレート中にプレート500万フェニックス同種指向性パッケージング細胞（PE）：10％ウシ血清を補充した1、。
2. 10 mMのカフェインを補足した新鮮な培地の5ミリリットルを用いたトランスフェクションの30分前にフィード細胞。
3. ミディプレップ（CDK4またはhTERTのプラスミド）およびpolyjetからのプラスミドDNAを2μgの混合物を均質化し、製造業者によって推奨されるように、15分間室温でインキュベートする。
4. 一晩PE細胞にプラスミド/ polyjet混合物を追加します。
5. 新鮮な培地を供給した細胞（DMEMと4の割合で199培地：10％ウシ血清を補充した1）。 12時間後、ウイル​​ス含有上清を収集し、0.45μmの孔径のフィルターを通して濾過する。
6. G41（いずれかの0.5mg / mlのネオマイシンを選択した後、一晩両栄養性パッケージング細胞系統PA317 ⁵に感染^し 、安定なウイルス産生細胞株を得るために収集された上清1mlを使用8）CDK4または0.5ミリグラムのために/ hTERTのためのmlハイグロ。
7. 3収穫のために毎朝、夕方と朝の上清を収穫その後、近くに密集するまで安定したパッケージング細胞を増殖させることによって作業ウイルス上清を準備します。
8. ウイルス上清を濾過し、直接、後で使用するために-80℃で1ミリリットルのアリコートとストアに使用したり、それらを分ける。ウイルス上清は、それぞれの凍結融解で50％の感染効率を失うことに注意してください。ウイルス粒子に触れたすべてのものを廃棄する前に洗浄を漂白することを忘れないでください。
   注：安定PA317ウイルス産生細胞株は、（凍結培地は、10％のDMSOで90％血清）永久記憶のために-150℃で凍結させ、維持することができる。
9. プレートFACS精製筋原細胞/ウェル、0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレート中で5×10 ⁴細胞の密度で（1.1から1.9のステップで説明する）。細胞がウイルス感染を進める前に、プレートに接続されていることを確認。
10. F、フィルタ400μLを追加reshly（コントロールとして2つのウェルを維持する）一晩各6ウェルプレートにウイルス上清または冷​​凍アリコートを生産した。
11. 2.5ミリリットル/ウェルの新鮮筋肉メディア（4で細胞を供給することにより、培地を変更します; 0.02 M HEPES緩衝液、1.4 mg / LのビタミンB12; 15％ウシ胎児血清を補充した1ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培地199 0.03ミリグラム/ LのZnSO 4、0.055 mg / Lのデキサメタゾン、2.5μg/ Lで、肝細胞増殖因子および10μg/ L塩基性線維芽細胞成長因子）。漂白剤容器内にウイルス粒子を含む培地とピペットを捨てます。どちらを400μg/ mlのネオマイシン（CDK4感染症）または300 / mlのハイグロ（hTERTの感染）を使用して、選択のための治療、その後、感染から回復するために3日間同じ培地中の細胞のままにしておきます。
12. 制御皿ダイ内の細胞（1〜2週間）まで、薬剤選択の下で細胞を維持する。
13. さえのSelectI中に、（EDTA、トリプシン、0.05％を使用して60〜80％の集密度）、継代細胞コンフルエントになる前に期間に。選択薬剤を補った新鮮な筋芽細胞培地で複数の10センチメートル皿でReplate細胞（2.11に記載されている）。完全に均一に遺伝的背景（すべてのセルにおける導入遺伝子の同じ挿入）を取得するために不均一集団またはクローンなどの不死化、選択したセルを維持します。
14. 次の手順を使用してクローン選択を実行します。
    1. （10cmの皿で例えば 300から500細胞）の低密度で細胞を播種し、小さなコロニーは（10〜20セル）が形成されるまで、約2週間のためにそれらを維持する。
    2. 乾燥から細胞を防ぐために、薄膜のみを残して、この時点で、培地のほとんどを除去する。
    3. 各所望のクローンの上（一端とシリコーン真空グリースに浸し）クローニングリングを配置し、トリプシン/ EDTAの数滴を追加します。
    4. 収穫細胞は、彼らは慎重に1ミリリットルチップまたはパスツールピペットを用いて細胞を吸引し、最小の利用可能なマルチウェルPLAにそれらを転送することによって丸くなるたらTE（96または48、24または12ウェルプレート）。
    5. 地元の集密度を防ぐために、必要に応じてクローンを展開します。

結果

図1は、一次組織解離に関与する重要なステップのいくつかを示しています。組織の正確な量は、無菌組織培養シャーレ（ 図1A、B）に秤量する。組織スラリー（ 図1C、D）が得られるまで、次に組織を微細に、無菌の外科用メスを用いて細かく切り刻まれる。消化酵素を添加した後、一次筋組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達?...

ディスカッション

便利な資源としての細胞

疾患のインビトロモデルにおけるまたは疾患の表現型を確立する際に筋原細胞集団の単離および文化は極めて有用である。ここで説明する筋原細胞単離手順は、次に、伝播分化、またはすぐに分析することができる骨格筋標本からの筋芽細胞および線維芽細胞の単離を可能にする。筋芽細胞の構造および機能は、細胞生存、細胞融合...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/mL	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/l vitamin B12; 0.03 mg/l ZnSO4, 0.055 mg/l dexamethasone, 2.5 μg/l hepatocyte growth factor and 10 μg/l beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50ml and 15ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50ml) ; C3394-1 (15ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10 and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5ml); 1200-10010 (10ml) ;1228-25050 (25ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100µm and 40µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010