تسخير الطلب Bioorthogonal معكوس الكترون ديلز-ألدر الإضافة الحلقية لPretargeted PET التصوير

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أداة لا غنى عنها السريرية في تشخيص وإدارة من السرطان. لطالما اعتبرت الأجسام المضادة ناقلات واعدة لتسليم النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون لأورام بسبب تقارب رائعة وخصوصية لالمؤشرات الحيوية للسرطان. ^1،2 ومع ذلك، فإن بطيئة نسبيا الدوائية في الجسم الحي من الأجسام المضادة ولايات استخدام النظائر المشعة مع عدة أيام المادية نصف حياة. وهذا يمكن الجمع تسفر الجرعات الإشعاعية العالية إلى الأجهزة غير المستهدفة من المرضى، وهي المضاعفات المهمة التي هي ذات الأهمية السريرية منذ يتم حقن radioimmunoconjugates عن طريق الوريد، وبالتالي - على عكس جزئية بمسح الجسم CT - نتيجة في جرعات استيعابها في كل جزء من أجزاء الجسم، بغض النظر عن الأنسجة للاستجواب.

من أجل تجاوز هذه المسألة، فقد تم تخصيص جهد كبير لdevelopment استراتيجيات التصوير PET أن فصل النظائر المشعة وشاردة الاستهداف، وبالتالي الاستفادة من خصائص مفيدة من الأجسام المضادة في حين التفاف على القيود في وقت واحد الدوائية الذاتية الخاصة بهم. هذه الاستراتيجيات - يطلق في معظم الأحيان pretargeting أو استهداف متعددة الخطوات - وعادة ما تستخدم أربع خطوات: (1) ادارة جسم مضاد قادر على حد سواء المستضد وجين مشع ملزمة؛ (2) تراكم الأجسام المضادة في الأنسجة المستهدفة وإزالة لها من الدم. (3) إدارة لجين مشع جزيء صغير. و (4) ربط في الجسم الحي من جين مشع إلى الأجسام المضادة التي تتبعها التخليص السريع للجين مشع الزائد. ^3-8 وفي بعض الحالات، يتم حقن عامل المقاصة إضافية بين الخطوتين 2 و 3 من أجل الإسراع في إفراز الأجسام المضادة أي التي لم لربط الورم ويبقى في الدم. ⁵

وبشكل عام، TWأنواع س استراتيجيات pretargeting هي الأكثر انتشارا في الأدب. في حين أثبتت كلا ناجحة في النماذج قبل السريرية، كما أنها تمتلك القيود الرئيسية التي أعاقت تطبيق السريرية الخاصة بهم. وتعتمد الاستراتيجية الأولى على تقارب عالية بين الأجسام المضادة streptavidin مترافق وradiolabels المعدلة البيوتين. ومع ذلك، فقد أثبتت المناعية للأجسام المعدلة streptavidin وجود مشكلة مقلقة فيما يتعلق الترجمة. ^5،6،9،10 الاستراتيجية الثانية، في المقابل، توظف الأجسام المضادة bispecific التي تم هندستها وراثيا لربط كل من السرطان مستضد العلامات البيولوجية وناشبة رديولبلد جزيء صغير. ^3،11-14 في حين أن هذا الطريق الأخير هو بالتأكيد الإبداعي وانطباقها اسع محدودة بسبب التعقيد، وحساب، وعدم وجود نمطية للنظام.

مؤخرا، قمنا بتطوير ونشر منهجية التصوير PET pretargeted بناء على الطلب معكوس الإلكترون ديلز-ألدر (IEDDA) رد فعل الإضافة الحلقية بين -cyclooctene العابرة (TCO) وtetrazine (TZ؛ الشكل 1) ¹¹ في حين أن رد الفعل نفسه كان معروفا منذ عقود، شهدت IEDDA الكيمياء نهضة في السنوات الأخيرة كأسلوب bioconjugation بنقرة والكيمياء، وكما يتضح من عمل رائع من مجموعات من رالف Weissleder، جوزيف فوكس، وبيتر كونتي وغيرها. وقد تم تطبيق ^12-15 وIEDDA الإضافة الحلقية في مجموعة واسعة من الإعدادات، بما في ذلك التصوير مضان مع الببتيدات، والأجسام المضادة، والجسيمات النانوية وكذلك التصوير النووي . مع كل radiohalogens وradiometals ^16-26 وربط عالية الغلة ونظيفة وسريعة (ك _1> 30،000 M ^-1 ثانية ^-1)، انتقائي، و- خطيرة -. bioorthogonal ²⁷ وعلى الرغم من عدد من أنواع نقرة الكيمياء - بما في ذلك أزيد آلكاين cycloadditions المحفز النحاس،-أزيد آلكاين cycloadditions-روجت سلالة، وشتاودينغر LIGations - هم bioorthogonal كذلك، هو مزيج فريد من حركية التفاعل بسرعة وbioorthogonality أن يجعل IEDDA الكيمياء ذلك مناسبة تماما لpretargeting التطبيقات في الكائنات كلها ^28،29 على طول هذه الخطوط، فمن المهم أن نلاحظ أن التقرير الأخير من وجهة نظرنا وكانت مختبرات يست الأولى لتطبيق IEDDA الكيمياء لpretargeting: نشأ التقرير الأول للتصوير pretargeted مع IEDDA من عمل روسين، وآخرون وظهرت منهجية SPECT بتوظيف ¹¹¹ tetrazine في المسمى ^30.

كما ناقشنا أعلاه، فإن منهجية pretargeting أربعة خطوات بسيطة إلى حد ما (الشكل 2). في البروتوكول في متناول اليد، ويمكن وصفها استراتيجية pretargeted للتصوير PET من سرطان القولون والمستقيم التي توظف ⁶⁴ النحاس وNOTA المسمى جين مشع tetrazine والمكورات تعديل TCO للأجسام المضادة huA33. ومع ذلك، في نهاية المطاف نمطية من هذه المنهجية هو واحد من غرام لهاتأكل الأصول، كما شاردة -cyclooctene المتحولة يمكن إلحاق أي الأجسام المضادة غير استيعاب، ويمكن أن تعلق tetrazine لمجموعة واسعة من المراسلين الإشعاعي.

Protocol

الأخلاق بيان: تم تنفيذ كافة من التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للميموريال سلون كيترينج للسرطان مركز المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC).

1. توليف TZ-BN-NOTA

1. في وعاء التفاعل صغيرة، ويحل 7 ملغ NH ₂ -Bn-NOTA (1.25 × 10 ^-2 ملمول) في 600 ميكرولتر NaHCO ₃ عازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 8.1). تحقق من الرقم الهيدروجيني للمحلول. إذا لزم الأمر، وضبط درجة الحموضة من الحل إلى 8.1 باستخدام مأخوذة صغيرة من 0.1 M نا ₂ CO _3.
2. إضافة NH ₂ حل -Bn-NOTA إلى 0.5 ملغ TZ-NHS (1.25 × 10 ^-3 ملمول) في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج.
   ملاحظة: TZ-NHS يمكن إما أن يكون وزنه من الجافة أو إضافتها من محلول المخزون من DMF الجاف أو DMSO (<50 ميكرولتر).
3. السماح للمحلول التفاعل الناتجة للرد لمدة 30 دقيقة في RTمع الإثارة معتدل.
4. بعد 30 دقيقة، وتنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C ₁₈ HPLC اللوني لإزالة غير المتفاعل NH ₂ -Bn-NOTA. وNH ₂ -Bn-NOTA يمكن رصدها عند طول موجي 254 نانومتر، في حين أن TZ-NHS وTZ-BN-NOTA من الأفضل مراقبة عند طول موجي 525 نانومتر من.
   ملاحظة: مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 0: 100 MeCN / H ₂ O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) إلى 100: 0 MeCN / H ₂ O أكثر من 25 دقيقة والتحليلي 4.6 × 250 ملم C ₁₈ عمود يستخدم ومرات الاحتفاظ TZ-BN-NOTA، TZ-NHS، وNH ₂ -Bn-NOTA ستكون حوالي 15 دقيقة، 16.5 دقيقة، و 10 دقيقة على التوالي. يمكن تنقية المنتج من مكونات رد فعل الأخرى إما في تشغيل واحد أو أشواط متعددة باستخدام عمود HPLC C ₁₈ شبه إعدادي أو إعدادي ¹ H-NMR، والشرجytical HPLC، وESI-MS كلها الأساليب التي يمكن استخدامها للتحقق من نقاء الانتهاء السلائف TZ-BN-NOTA ¹¹
5. تجميد شاطف HPLC جمعها باستخدام النيتروجين السائل.
6. التفاف أنبوب جمع المجمدة في مبهمة رقائق الألومنيوم.
7. وضع أنبوب جمع المجمدة في lyophilizing سفينة O / N لإزالة الطور المتحرك HPLC.
8. تخزين المنتج النقي (وردي مشرق الصلبة) في الظلام في -80 ° C.
   ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. وأكملت السلائف TZ-BN-NOTA مستقر لا يقل عن 1 سنة في ظل هذه الظروف.

2. إعداد huA33-TCO Immunoconjugate

1. في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 1 ملغ / مل (2.7 ملم) حل TCO-NHS في DMF الجاف.
2. في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج، وإعداد 2 ملغ / مل (13.3 ميكرومتر) حل huA33 في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة 7.4 (0.01 M PO _{4 ^3-،} 0.154 M كلوريد الصوديوم).
3. باستخدام مأخوذة صغيرة (<5 ميكرولتر) من 0.1 M نا ₂ CO _3، وضبط درجة الحموضة من الحل الضد إلى 8،8-9،0. استخدام أي ورقة درجة الحموضة أو الرقم الهيدروجيني متر مع مسرى مكروي لمراقبة درجة الحموضة، ويجب الحرص على عدم السماح للدرجة الحموضة على الارتفاع فوق درجة الحموضة 9.0.
4. وبمجرد أن حل الضد هو في درجة الحموضة الصحيحة، إضافة إلى حجم من الحل TCO-NHS الموافق 8 حكمه ضرس استر تفعيلها. على سبيل المثال، إضافة 7.9 ميكرولتر من 1 ملغ / مل TCO-NHS الحل (1.07 × 10 ^-7 مول TCO-NHS) إلى 1 مل من محلول 2 ملغ / مل huA33 الأجسام المضادة (1.33 × 10 ^-8 مول huA33). لا تتجاوز 5٪ DMF من حيث الحجم في الحل.
5. المزيج بلطف الحل عن طريق قلب لأنبوب microcentrifuge عدة مرات.
6. التفاف أنبوب microcentrifuge مبهمة في رقائق الألومنيوم.
7. السماح للحل لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT مع الإثارة معتدل.
8. بعد 1 ساعة على RT، وتنقية immunoconjugate الناتجة باستخدام الاحجام المتاح معبأة مسبقاالبريد استبعاد العمود تحلية. أولا، وشطف العمود حجم الإقصاء كما هو موضح من قبل المورد لإزالة أي مواد حافظة موجودة على العمود أثناء التخزين. ثم، تضاف خليط التفاعل إلى العمود حجم الإقصاء، وشطف العمود مع 1.5 مل 0.9٪ ملحي معقم، وبعد ذلك جمع المنتج باستخدام 2 مل من 0.9٪ ملحي معقم مثل شاطف.
   ملاحظة: هذه الخطوة سوف تسفر عن الانتهاء huA33-TCO كحل 2 مل.
9. قياس تركيز الناتجة huA33-TCO على الأشعة فوق البنفسجية فيس معمل.
10. إذا كان المطلوب تركيز أعلى، والتركيز على حل huA33-TCO باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع 50،000 الوزن الجزيئي قطع.
    ملاحظة: من المهم أن نلاحظ أنه في حين huA33 ومجموعة متنوعة من الأجسام المضادة المعروفة الأخرى (على سبيل المثال، بيفاسيزوماب، تراستوزوماب، ستوكسيماب، وJ591) ومتسامح جدا من أن تتركز، يمكن أن تحدث التجميع وهطول الأمطار على التركيز في حالات أخرى. الباحثون محاولة هذا procedلدى عودتهم مع الأجسام المضادة الجديد يجب أن تثق في الأدب أو المعرفة الخاصة بهم من الأجسام المضادة في سؤال بشأن ما إذا كان أو لم يكن لتركيز الأجسام المضادة.
11. تخزين الانتهاء immunoconjugate huA33-TCO في 4 درجات مئوية في الظلام.
    ملاحظة: هذا هو نقطة توقف مقبولة في الإجراء. يجب أن يكون الانتهاء المكورات ماب-TCO مستقر لمدة 3 أشهر على الأقل في ظل هذه الظروف التخزين.

3. ⁶⁴ النحاس Radiolabeling من TZ-BN-NOTA

ملاحظة: هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات - أو أداء أي عمل آخر مع النشاط الإشعاعي - الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين.

1. في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل، وإعداد 0.5 ملغ / مل (723 ميكرومتر) حل TZ-BN-NOTA.
2. في microc 1.7 ملأنبوب entrifuge، إضافة 10 ميكرولتر من الحل TZ-BN-NOTA (5 ميكروغرام) إلى 400 ميكرولتر من 0.2 M NH ₄ OAC درجة الحموضة 5.5 _{العازلة.}
3. في مصلحة الكيمياء الإشعاعية المناسبة لحفظ المذكرة، وقياس وتسجيل كمية النشاط الإشعاعي في العينة باستخدام تدريج جرعة قبل وبعد الخطوات التي تلت ذلك في البروتوكول أدناه (3،4-3،8). وهذا سوف يساعد مع تحديد دقيق لعائدات الإشعاعية.
4. إضافة 2،000 μCi (74 من mbq) من ⁶⁴ النحاس إلى حل TZ-BN-NOTA.
   ملاحظة: عادة، ^[64 النحاس] CuCl ₂ يتم توفير في حجم صغير (<30 ميكرولتر) من 0.1 N حمض الهيدروكلوريك، وبالتالي فقط كميات صغيرة (<10 ميكرولتر) هناك حاجة إلى هذا الحل الأسهم للتفاعل radiolabeling. إذا كانت هناك حاجة كميات أكبر من ^[64 النحاس] CuCl ₂ الأوراق المالية، ورد فعل radiolabeling متسامح زيادة حجم رد الفعل الكلي. ومع ذلك، ينبغي رصد الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل radiolabeling بعناية لضمانأنها لا تقع تحت الرقم الهيدروجيني 4.0.
5. السماح للحل لاحتضان لمدة 10 دقيقة في RT مع الإثارة معتدل.
6. بعد 10 دقيقة من الحضانة، تنقية المنتج باستخدام عكس المرحلة C ₁₈ HPLC اللوني. مرات الاحتفاظ ومن الواضح أن تعتمد اعتمادا كبيرا على الإعداد المعدات HPLC من كل مختبر (مضخات، والأعمدة، وأنابيب، وغيرها). ومع ذلك، لتقديم سبيل المثال، إذا كان التدرج من 5:95 MeCN / H ₂ O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) ل95: 5 MeCN / H ₂ O أكثر من 15 دقيقة يتم استخدامها، والوقت الاحتفاظ من ⁶⁴ النحاس وTz- BN-NOTA ينبغي أن يكون حول 9.8 دقيقة في حين سيكون مجانا، uncomplexed ⁶⁴ النحاس أزل مع الجبهة المذيبات في حوالي 2-4 دقائق.
7. باستخدام المبخر الدوار، وإزالة شاطف HPLC.
8. تنحل المنتج ⁶⁴ النحاس وTZ-BN-NOTA في 0.9٪ ملحي معقم.
   ملاحظة: نظرا ل12.7 ساعة الجسدية نصف العمر ^لل64 النحاس، هذه ليست نقطة توقف مقبولة في الإجراء. أداء توليف ⁶⁴ النحاس وTZ-BN-NOTومباشرة قبل حقن جين مشع، واتبع الخطوة 3.7 على الفور من قبل الخطوة 4.5.

4. في فيفو Pretargeted PET التصوير

ملاحظة: كما هو الحال في القسم بروتوكول 3، هذه الخطوة من البروتوكول ينطوي على التعامل والتلاعب من النشاط الإشعاعي. قبل تنفيذ هذه الخطوات الباحثون أن يتشاور مع إدارة الصحة والسلامة من الإشعاع مؤسسة وطنهم و. اتخاذ جميع الخطوات الممكنة للحد من التعرض للإشعاع المؤين.

1. في ماوس عارية athymic الإناث، وزرع تحت الجلد 1 × 10 ⁶ SW1222 خلايا سرطان القولون والمستقيم والسماح لهؤلاء لتنمو لتصبح 100-150 ملم ³ طعم أجنبي (بعد 9-12 أيام التلقيح). ¹¹
2. تمييع قسامة من الحل huA33-TCO من القسم بروتوكول 2 إلى تركيز 0.5 ملغ / مل في 0.9٪ ملحي معقم.
3. ضخ 200 ميكرولتر من الحل huA33-TCO (100 ميكروغرام) في الوريد ذيل الفأر طعم أجنبي الحاملة.
4. اسمحوا 24 ساعة لتراكم huA33-TCO في الورم من الفأرة.
5. تمييع ⁶⁴ النحاس وTZ-BN-NOTA جين مشع إلى تركيز 1.5 ميلي كوري / مل في 0.9٪ ملحي معقم.
6. ضخ 200 ميكرولتر من ⁶⁴ النحاس وTZ-BN-NOTA حل لجين مشع (300 μCi، 11.1 من mbq؛ 1.6 نانومول من ⁶⁴ النحاس وTZ-BN-NOTA، على افتراض نشاط معين 6.7 من mbq / نانومول) في الوريد ذيل الفئران الحاملة للطعم أجنبي.
7. في نقطة زمنية التصوير المطلوب (على سبيل المثال، 2، 6، 12، أو 24 ساعة بعد الحقن)، تخدير الماوس مع الأيزوفلورين 2٪: خليط غاز الأكسجين.
8. ضع الماوس على السرير من صغير الماسح الضوئي PET الحيوان. الحفاظ على التخدير أثناء الفحص باستخدام الأيزوفلورين 1٪: خليط غاز الأكسجين. قبل وضع الحيوان على السرير الماسح الضوئي، تحقق من التخدير باستخدام طريقة إصبع القدم قرصة وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير.
9. الحصول على البيانات PET الماوس عن طريق ثابتمسح مع حد أدنى من 20 مليون الأحداث المتزامنة باستخدام نافذة الطاقة من 350-700 كيلو وتوقيت نافذة صدفة من 6 NSEC. بعد الانتهاء من الاستحواذ على الصورة، لا تترك الماوس غير المراقب وليس لوضعه في قفص مع فئران أخرى حتى استعاد وعيه عليه.

النتائج

الخطوات الثلاث الأولى من التجربة - تركيب TZ-BN-NOTA، والاقتران من TCO لhuA33، وradiolabeling من TZ-BN-NOTA بناء من (أرقام 3 و 4) - هي موثوق بها للغاية. في حالة الإجراء أعلاه، تم تصنيعه في بناء TZ-BN-NOTA في ارتفاع العائد والنقاء. تم تعديل الأجسام المضادة huA33 مع 4.2 ± 0.6 TCO / ماب، وكا...

Discussion

والميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية التصوير PET pretargeted هو أنه قادر على ترسيم الأورام مع الهدف إلى خلفية تباين الصورة في جزء فقط من الجرعة إشعاع الخلفية التي تنتجها الأجسام المضادة المسمى مباشرة. على سبيل المثال، في نظام التصوير سرطان القولون والمستقيم وصفها هنا، تم تو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C