Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

요약

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

초록

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

서문

지난 30 년 동안, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 암의 진단 및 관리에 필수적인 임상 도구가되었다. 항체는 긴 암 바이오 마커에 ​​대한 그들의 절묘한 친화력과 특이성으로 인해 종양 양전자 방출 방사성 동위 원소의 전달을위한 유망한 벡터를 고려하고있다. 항체의 ^{1, 2} 단, 상대적으로 느린 생체 내 약물 동태는 여러 날에 방사성 동위 원소의 사용을 의무화 물리적 반감기. 부분 바디 CT 스캔 달리 - - 조합은 환자의 비 - 표적 기관, radioimmunoconjugates 정맥 따라서 주입되기 때문에 특히 임상 적 의의이다 중요한 합병증 높은 방사선 량을 수득 할 결과를 흡입 투여로 신체의 모든 부분에서, 심문 조직에 관계없이.

이 문제를 우회하기 위해 상당한 노력을 develo의 전념하고있다동시에 내재 약동학 적 한계를 둘러싸하면서함으로써 항체의 유리한 특성을 활용, 방사성 동위 원소 및 표적 부분을 분리 PET 영상 전략의 pment. 이러한 전략은 - 가장 자주 pretargeting 또는 다단계 타겟팅라고 - 전형적으로 네 단계를 채택한다 : (1) 항원 및 방사성 리간드를 모두 결합 할 수있는 항체의 투여; (2) 표적 조직 및 혈액에서 그 간극에서 항체의 축적; (3) 작은 분자 방사성 리간드의 투여; 및 (4)를 초과하는 방사성 리간드의 급속한 냄. 일부 경우에 ^3-8 이어 항체에 방사성 리간드의 생체 결찰은 추가적인 소거 에이전트는 항체의 배설을 촉진시키기 위해 단계 (2)와 (3) 사이에 주입된다 그 종양을 결합 아직 혈액에 남아 있습니다. ⁽⁵⁾

대체로, TW를 말하기pretargeting 전략의 O 유형은 문학에서 가장 널리 있습니다. 모두 전임상 모델에서 성공적으로 검증되었지만, 그들은 또한 임상 적용을 방해 한 키 제한을 갖는다. 첫 번째 전략은 스트렙 타비 딘 - 복합 항체와 비오틴 - 수정 방사능 표지 사이의 높은 친화력에 의존; 그러나, 스트렙 타비 딘 - 수정 항체의 면역 원성은 번역과 관련하여 우려되는 문제로 입증되었습니다. ^5,6,9,10 두 번째 전략은, 대조적으로, 암을 모두 결합하는 유전자 조작 된 특이 적 항체를 사용 후자의 경로가 확실히 창조적 인 반면 바이오 마커 항원과 작은 분자 방사성 동위 원소 표지 합텐. ^3,11-14은 광범위한 적용은 시스템의 모듈 방식의 복잡성, 비용 및 부족에 의해 제한됩니다.

최근에는 개발 (역 전자 수요 딜스 - 알더 I에 기초를 pretargeted PET 이미징 방법을 게시EDDA) 트랜스 -cyclooctene (TCO) 및 테트라 (Tz 일 사이의 고리 화 반응;.에 의해 예시 그림 1) ⁽¹¹⁾ 반응 자체가 수십 년 동안 알려져있다 동안은 IEDDA 화학은 클릭 화학 바이오 콘쥬 게이션 기술로 최근 몇 년 동안 르네상스를 경험하고있다 랄프 Weissleder, 조셉 폭스, 펩티드, 항체 및 나노 입자의 형광 이미지 등을 포함한 ^12-15 IEDDA의 고리가 설정의 넓은 범위에서 적용되었다. 다른 중에서 피터 콘티의 기의 매혹적인 작품뿐만 아니라 핵 이미징 .. ²⁷ bioorthogonal 클릭 화학의 종류의 숫자 동안 - 비판적 - radiohalogens 및 radiometals 모두 ^16-26 결찰은 항복 높은 깨끗하고 빠른 (K _1> 30,000 M ^-1 초 ^-1), 선택하고, - 구리 촉매 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 변형 승진 아 지드 - 알킨 cycloadditions, 그리고 슈타 우 딩거 LIG 손해 포함관리 포인트 -. 그것은 전체 유기체에서 응용 프로그램을 pretargeting에 매우 적합 IEDDA 화학을하게 빠른 반응 속도와 bioorthogonality의 고유 한 조합뿐만 아니라 bioorthogonal있는이 라인을 따라 ^{28, 29,} 그것의 최근 보고서 것이 중요합니다 우리의 실험실 pretargeting에 IEDDA 화학을 첫 적용되지 않았습니다. IEDDA와 pretargeted 영상의 첫 번째 보고서는 Rossin의 작업, 등에서 일어나 ^(111)에 표지 테트라를 사용하는 SPECT 방법론을 기능을 갖춘 ^30.

우리는 상술 한 바와 같이, pretargeting 방법은 네 가지 매우 간단한 단계 (그림 2). 손 프로토콜, ⁶⁴ CU-NOTA 표지 된 방사성 리간드 및 테트라 huA33 항체의 TCO 변성 공액을 채용 대장 암 PET 이미징 pretargeted 전략을 설명한다. 그러나,이 방법의 궁극적 모듈화는 GR 중 하나입니다트랜스 -cyclooctene 잔기로서 eatest 자산은 비 내재화 항체에 추가 될 수 있고, 테트라 방사성 기자의 다양한 부착 될 수있다.

프로토콜

윤리 선언문 : 설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다.

의 Tz-BN-NOTA 1. 합성

1. 작은 반응 용기에 600 μL의 _NaHCO3 완충액 (0.1 M, pH를 8.1) 7 MG-NH ₂ -Bn NOTA (1.25 X ^10-2 밀리몰)을 용해. 용액의 pH를 확인합니다. 필요한 경우, CO ₃ 0.1 M _나트륨이 적은 분취 량을 사용하여 8.1로 용액의 pH를 조정한다.
2. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 0.5 MG의 Tz-NHS (1.25 × 10 ^-3 밀리몰)에 NH ₂ -Bn-NOTA 솔루션을 추가합니다.
   참고 : (Tz)를-NHS는 건식 칭량 또는 건조 DMF 또는 DMSO (<50 μL)의 원액에서 추가 할 수 있습니다.
3. 생성 된 반응 용액을 RT에서 30 분 동안 반응하도록 허용가벼운 교반.
4. 30 분 후, _반응이 -Bn NH-NOTA을 제거하는 역상 C ₁₈ HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 의 Tz-NHS-BN과의 Tz-NOTA 가장 525 nm의 파장에서 모니터하면서 ₂ -Bn NH-NOTA는 254 nm의 파장에서 모니터 할 수있다.
   참고 : 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제시하는 경우 0의 기울기 : (100)를 MeCN이 / H ₂ O는 100 (모두 0.1 % TFA와 함께) : 0의 MeCN / H ₂ O를 통해 25 분 및 분석 4.6 × 250mm의 C ₍₁₈₎ 열 사용 ,의 Tz-BN-NOTA, Tz 일-NHS 및 NH _(2)의 체류 시간은 -Bn-NOTA 각각 약 15 분, 16.5 분, 10 분, 것이다. 생성물 일층 또는 반 제조용 또는 C ₁₈ 분 취용 HPLC 컬럼을 사용하여 여러 개의 실행 중의 다른 성분의 반응으로부터 정제 할 수있다. ¹ H-NMR, 항문ytical HPLC 및 ESI-MS는 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체의 순도를 확인하는 데 사용할 수있는 모든 방법이있다. ⁽¹¹⁾
5. 액체 질소를 이용하여 수집 용 HPLC 용출액을 동결.
6. 불투명 한 알루미늄 호일에 얼어 붙은 수집 튜브를 감싸.
7. 동결 건조 선박 O에 얼어 붙은 포집 관을 배치 / N은 ​​HPLC 이동상을 제거합니다.
8. -80 ° C에서 어둠 속에서 정제 된 제품 (고체 밝은 분홍색)을 저장합니다.
   참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완료의 Tz-BN-NOTA 전구체는 이러한 조건 하에서 1 년 이상 안정하다.

huA33-TCO 면역 접합체 2. 준비

1. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서, 1 ㎎ / ㎖ 건조 DMF에 TCO-NHS의 (2.7 mM)을 용액을 제조.
2. 1.7 ml의 마이크로 원심 분리 _{튜브에서,} 2 ㎎ / ㎖의 인산 완충 생리 식염수를 1ml의 huA33 (13.3 μM) 용액의 pH 7.4 (0.01 M PO ₄ ^{3- 준비} 0.154 M의 NaCl).
3. 작은 분취 량 0.1 M 나 ₂ CO ₃ (<5 μL)을 사용하여, 8.8-9.0로 항체 용액의 pH를 조정한다. pH를 모니터링하는 미세 전극으로 pH 종이 또는 pH 측정기를 사용하고, pH가 9.0 이상 오르지 않도록주의하십시오.
4. 항체 용액은 정확한 pH에서되면, 활성화 된 에스터 8 몰 당량에 대응하는 TCO-NHS 용액의 볼륨. 예를 들어, 2 ㎎ / ㎖ huA33 항체 용액 (1.33 × 10 ^-8 몰 huA33)의 1 ml의 1 ㎎ / ㎖ TCO-NHS 용액 (1.07 × 10 ^-7 몰 TCO-NHS)의 7.9 μl를 추가합니다. 용액의 부피 5 % DMF를 초과하지 마십시오.
5. 부드럽게 microcentrifuge 관을 여러 번 반전하여 솔루션을 섞는다.
6. 불투명 한 알루미늄 호일의 microcentrifuge 관을 감싸.
7. 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양 할 수 있습니다.
8. RT에서 1 시간 후, 사전 포장 된 일회용 SIZ를 사용하여 생성 된 면역 접합체를 정제전자 제외 탈염 열입니다. 보관시 컬럼에 존재하는 방부제를 제거하기 위해 공급자에 의해 설명 된 바와 같이 첫째, 크기 배제 열을 씻어. 그 후, 크기 배제 컬럼에 반응 혼합물을 추가 1.5 ㎖의 0.9 % 멸균 식염수와 열 린스,이어서 용 리제로서 0.9 % 멸균 식염수 2 ㎖를 사용하여 제품을 수집한다.
   참고 :이 단계는 2 ml의 솔루션으로 완성 된 huA33-TCO를 얻을 것입니다.
9. 분광 광도계 UV-비스에서 얻어진 huA33-TCO의 농도를 측정한다.
10. 높은 농도가 요구되는 경우, 50,000 분자량 컷 - 오프로 원심 필터 유닛을 이용 huA33-TCO 용액을 농축시킨다.
    주 : huA33 및 기타 잘 알려진 항체 (예를 들어, 베바 시주 맙, 트라 스투 주맙, 세툭시 맙 및 J591)의 다양한 집중되는 매우 관대 한 반면, 집계 및 침전이 다른 경우 농도에 따라 발생할 수 있음을 유의해야합니다. 연구진은이 proced 시도새로운 항체 올바는 문학 또는 항체를 집중할지 여부와 관련하여 문제가되는 항체의 자신의 지식을 신뢰해야합니다.
11. 어둠 속에서 4 ° C에서 완성 된 huA33-TCO의 면역을 저장합니다.
    참고 :이 절차의 허용 정지 점이다. 완성 된 단클론 항체 접합체-TCO이 보관 조건에서 3 개월 이상 안정해야한다.

의 Tz-BN-NOTA 3. ⁶⁴ 구리의 방사선

참고 : 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 방사능과 다른 작업을 수행 - - 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다.

1. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 0.5 ㎎ / ㎖ (723 μM)의 Tz-BN-NOTA의 솔루션을 준비합니다.
2. 1.7 ML의는 MicroC에서entrifuge 튜브, 0.2 M NH ₄ OAC의 pH 5.5 완충액 400 μL에의 Tz-BN-NOTA 용액 (5 μg의) 10 μl를 _{추가합니다.}
3. 적절한 방사 화학 노트 유지의 관심에서 측정하기 전에 아래의 프로토콜 (3.4-3.8)에서 다음의 단계 후 투여 교정기를 사용하여 샘​​플에서 방사능의 양을 기록한다. 이 방사 화학적 수율의 정확한 결정에 도움이 될 것입니다.
4. 의 Tz-BN-NOTA 솔루션 ⁽⁶⁴⁾ 구리의 2,000 μCi를 (74 MBq의)를 추가합니다.
   주 : 일반적으로, ^[64의 Cu]의 CuCl _2는 0.1 N HCl을 소량 (<30 μL)에 공급되고, 따라서 단지 소량은 (<10 μL)이 스톡 용액은 방사성 표지 반응에 필요하다. ^[64의 Cu]의 CuCl ₂ 콘텐츠의 많은 양이 필요할 경우, 방사성 표지 반응은 전체 반응 부피를 증가 관대하다. 그러나, 방사성 표지 반응 용액의 pH를 보장하기 위해주의 깊게 모니터링되어야이는 pH가 4.0 이하로 떨어지지 않습니다.
5. 이 솔루션은 온화한 교반과 함께 실온에서 10 분 동안 품어하도록 허용합니다.
6. 인큐베이션 10 분 후, 역상 C ₁₈ HPLC 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제. 체류 시간은 분명히 각 실험실 (펌프, 열, 튜브 등)의 HPLC 장비 설치에 크게 의존한다. 그러나, 예를 제공하는 경우의 구배 5:95의 MeCN / H ₂ O 95 (모두 0.1 % TFA 사용) : 5의 MeCN / H ₂ O 15 분 동안 사용하는, ⁶⁴ CU-Tz-의 체류 시간 무료, 복합체를 형성하지 못한 ⁶⁴ Cu를 약 2-4 분에서 용매 전면으로 용출 반면 BN-NOTA은 약 9.8 분이어야합니다.
7. 회전 증발기를 사용하여, HPLC 용 출제를 제거.
8. 0.9 % 멸균 식염수에 ⁶⁴ CU-의 Tz-BN-NOTA 생성물을 재용.
   주 : ⁽⁶⁴⁾ 구리의 12.7 시간의 물리적 반감기를 고려할 때,이 절차의 허용 정지 점 없습니다. ^64의 합성 CU-의 Tz-BN을-NOT 수행방사성 리간드의 주입 직전에, 스텝 4.5 즉시 3.7 단계에 따르십시오.

생체 Pretargeted PET 영상 4.

참고 : 프로토콜 제 3 절에서와 같이, 프로토콜의이 단계는 취급 및 방사능의 조작을 포함한다. 다음 단계를 수행하기 전에 연구자들은 자신의 집 기관의 방사선 안전 부서와상의해야합니다. 이온화 방사선에 대한 노출을 최소화하기 위해 가능한 모든 조치를 취합니다.

1. 그리고 여자를 누드 마우스 피하 이식 1 × ⁶ SW1222 대장 암 세포에서하는 것은 이러한 (9~12일 접종 후) 100-150mm ³ 이종 이식으로 성장 할 수 있습니다. ⁽¹¹⁾
2. 0.9 % 멸균 식염수에 0.5 ㎎ / ㎖의 농도로 제 2 프로토콜로부터 huA33-TCO 용액의 분취 액을 희석한다.
3. 이종 - 함유 마우스의 꼬리 정맥 내로 huA33-TCO 용액 200 μL (100 μg의)을 주입.
4. 마우스의 종양에서 huA33-TCO의 축적을위한 24 시간을 허용합니다.
5. 0.9 % 멸균 식염수에서 1.5 mCi의 / ml의 농도로 ⁶⁴ CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드를 희석.
6. 의 꼬리 정맥 내로 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활성을 가정하면, ⁶⁴ CU-의 Tz-BN-NOTA 1.6 nmol의; 11.1 MBq 내지 300 μCi를) ⁶⁴ CU-의 Tz-BN-NOTA 방사성 리간드 용액 200 μl를 주입 이종 이식 베어링 쥐.
7. 촬상 원하는 시점에서 (예를 들어, 2, 6, 12, 또는 24 시간 후 분사), 2 % 이소 플루 란 마취 마우스 : 산소 가스 혼합물.
8. 작은 동물 PET 스캐너의 침대에 마우스를 놓습니다. 산소 가스 혼합물 : 1 % 이소 플루 란을 이용하여 스캔하는 동안 마취를 유지한다. 스캐너 침대에 동물을 배치하기 전에, 토​​우 - 핀치 방법을 사용하여 마취를 확인하고 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈 연고 수의학 적용.
9. 정적 통해 마우스 PET 데이터를 획득350-700 keV의 에너지의 창 6 나노초의 일치 타이밍 윈도우를 사용하여 2000 만 일치 이벤트 최소 스캔. 이미지의 인수를 완료 한 후, 무인 마우스를 벗어나지 않아이 의식을 회복 할 때까지 다른 마우스와 케이지로 변경하지 마십시오.

결과

실험의 처음 세 단계 -의 Tz-BN-NOTA, huA33에 TCO의 접합의 합성과의 Tz-BN-NOTA의 방사성 표지는 (도 3 및도 4) 구성 - 매우 안정적. 상기 절차의 경우의 Tz-BN-NOTA 구조체는 고 수율 및 고순도로 합성 하였다. ~ huA33 항체는 4.2 ± 0.6 TCO / 단클론 항체로 수정하고, Tz 일-BN-NOTA은> 85 % 붕괴 보정 수율, 그리고 특정 활동> 99 % 방사 화학적 순도 정제 된 방사성 리간드를 얻을 수 ⁽⁶⁴⁾ 구리와 방...

토론

이 PET pretargeted 촬상 전략의 주요 장점은 직접 표지 된 항체에 의해 생성 된 배경 방사선 량의 단지 일부만 타겟 간 배경 화상의 콘트라스트를 종양의 윤곽을 할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 여기에 설명 된 대장 암 이미징 시스템에서, 급성 생체 분포 실험의 데이터는 표지 된 ⁶⁴ CU-NOTA-huA33 ⁸⁹ ZR-DFO-huA33 함께 ⁶⁴ Cu- 기 pretargeting 전략 선량 계산을 수행하는 데 사용 하였다. 임...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C