Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

Resumo

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Resumo

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introdução

Ao longo dos últimos trinta anos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico e tratamento do câncer. Os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos emissores de positrões para tumores devido à sua afinidade e especificidade para requintado biomarcadores de cancro. ^1,2 farmacocinética No entanto, a relativamente lenta in vivo de anticorpos exige a utilização de radioisótopos com multi-dia semi-vidas físicas. Esta combinação pode render altas doses de radiação para os órgãos não-alvo de doentes, uma importante complicação que é de especial importância clínica desde radioimunoconjugados são injetados por via intravenosa e, portanto, - ao contrário de tomografias corpo parciais - resultado em doses absorvidas em cada parte do corpo, independentemente dos tecidos interrogados.

A fim de contornar este problema, esforço significativo foi dedicado ao desenvolvimento de estratégias de imagem PET que dissociar o radioisótopo e do grupo alvo, o que reforça as propriedades vantajosas de anticorpos contornando simultaneamente suas limitações farmacocinéticos intrínsecos. Estas estratégias - mais frequentemente denominado pr�marca�o ou segmentação de várias etapas - empregam tipicamente quatro passos: (1) a administração de um anticorpo capaz de se ligar tanto a um antigénio e um radioligando; (2) a acumulação de anticorpos no tecido-alvo e a sua depuração do sangue; (3) a administração de uma pequena molécula radioactivo; e (4) da ligação in vivo do ligando radioactivo ao anticorpo, seguido pela rápida eliminação do excesso de radioligando ^3-8 Em alguns casos., um agente de compensação adicional é injectado entre as etapas 2 e 3, a fim de acelerar a eliminação de qualquer anticorpo que ainda tem que se ligar o tumor e permanece no sangue. ⁵

Em termos gerais, twO tipos de estratégias pré-direccionamento são mais prevalentes na literatura. Embora ambos provaram ser um sucesso em modelos pré-clínicos, eles também possuem limitações fundamentais que têm impedido a sua aplicabilidade clínica. A primeira estratégia baseia-se na elevada afinidade entre os anticorpos e conjugados estreptavidina-radiomarcadores modificados com biotina; no entanto, a imunogenicidade dos anticorpos modificados com estreptavidina provou ser um problema preocupante no que diz respeito à tradução. ^5,6,9,10 A segunda estratégia, em contrapartida, utiliza anticorpos biespecíficos que foram geneticamente modificadas para se ligarem tanto um cancro antigénio biomarcador e um pequeno hapteno marcado radioactivamente molécula. ^3,11-14 Embora esta última via é certamente criativa, a sua ampla aplicabilidade é limitada pela complexidade, custo e falta de modularidade do sistema.

Recentemente, desenvolveu e publicou uma metodologia de imagem PET pretargeted baseado na procura de elétron inversa Diels-Alder (IEDDA) reação de cicloadição entre -cicloocteno trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) ¹¹ Embora a própria reação tem sido conhecida há décadas, IEDDA química experimentou um renascimento nos últimos anos como uma técnica bioconjugação clique química, como ilustrado pelo o trabalho fascinante dos grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, e Peter Conti entre outros. ^12-15 A IEDDA cicloadição foi aplicado numa grande variedade de configurações, incluindo imagiologia por fluorescência com péptidos, anticorpos e nanopartículas, bem como imagiologia nuclear . com ambas radiohalogens e radiometais ^16-26 A ligação é de alto rendimento, limpo, rápido (k _1> 30.000 ^{M-1 s-1),} seletivo, e - criticamente -. bioorthogonal ²⁷ E, enquanto uma série de tipos de clique química - incluindo cicloadições catalisada por Cu azida-alcino, cicloadições azida-alcino promoveu-deformação e Staudinger ligções -. bioorthogonal estão bem, é a combinação única de cinética de reação rápida e bioorthogonality que faz IEDDA química tão bem adaptado para pr�marca�o aplicações em organismos inteiros ^28,29 Nesse sentido, é importante notar que o relatório recente da nossa laboratórios não foi o primeiro a aplicar IEDDA química para pr�marca�o: o primeiro relato da imagem pretargeted com IEDDA surgiu a partir do trabalho de Rossin, et al e contou com uma metodologia SPECT empregando um ¹¹¹ tetrazina Em marcado ^30..

Como discutimos acima, a metodologia pr�marca�o tem quatro passos bastante simples (Figura 2). No protocolo a mão, uma estratégia para a pretargeted imagens PET de cancro colo-rectal que emprega uma ⁶⁴ Cu-NOTE-radioligando marcado tetrazina e um conjugado de TCO-modificada do anticorpo huA33 será descrito. No entanto, em última análise, a modularidade desta metodologia é um dos seus grEatest activos, como a porção -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo não de internalização, e o tetrazina pode ser ligado a uma vasta variedade de repórteres radioactivos.

Protocolo

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Síntese de Tz-Bn-NOTA

1. Num recipiente de reacção pequeno, dissolver 7 mg _NH2-Bn-NOTE (1,25 x ¹⁰ ~ 2 mmol) em 600 ul de tampão de _NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Verificar o pH da solução. Se necessário, ajustar o pH da solução para 8,1 utilizando pequenas alíquotas de 0,1 M de Na ₂ CO _3.
2. Adicionar a solução de NH _2-Bn-NOTE a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 ^-3 mmol) num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
   NOTA: O Tz-NHS pode ser pesadas seco ou adicionado de uma solução de estoque de DMSO ou DMF seco (<50 ul).
3. Permitir que a solução de reacção resultante a reagir durante 30 min à TAcom agitação moderada.
4. Após 30 min, purificar o produto utilizando cromatografia em C ₁₈ de HPLC de fase reversa, para remover não reagido _NH2-Bn-NOTE. O NH ₂ -Bn-NOTA pode ser monitorado em um comprimento de onda de 254 nm, enquanto o Tz-NHS e Tz-Bn-NOTA são melhor monitorados em um comprimento de onda de 525 nm.
   NOTA: Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 0: 100 de MeCN / H ₂ O (ambos com 0,1% de TFA) até 100: 0 de MeCN / _H2O ao longo de 25 min e uma analítica de 4,6 x 250 mm coluna C ₁₈ é usada , os tempos de retenção de Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e _NH2-Bn-NOTE será de cerca de 15 min, 16,5 min e 10 min, respectivamente. O produto pode ser purificado a partir de outros componentes da reacção em um único ou múltiplos de execução é executado utilizando uma coluna C ₁₈ preparativa ou semi-preparativa de HPLC. ¹ H-RMN, analytical HPLC e ESI-MS são todos os métodos que podem ser utilizados para verificar a pureza do precursor de completada Tz-Bn-NOTE ^11.
5. Congelar o eluente HPLC coletados utilizando nitrogênio líquido.
6. Enrole o tubo de coleta congelado em papel de alumínio opaco.
7. Colocar o tubo de recolha congelado num recipiente de liofilização S / N para remover a fase móvel de HPLC.
8. Armazenar o produto purificado (um sólido cor de rosa claro) no escuro a -80 ° C.
   NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O precursor Tz-Bn-NOTE concluída é estável durante pelo menos 1 ano, sob estas condições.

2. Preparação de huA33-TCO Imunoconjugado

1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar um 1 mg / ml de solução de TCO-NHS em DMF seca (2,7 mM).
2. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de (13,3 mM) de huA33 em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (0,01 M de PO ₄ ^3- 2 mg / _ml, 0,154 M de NaCl).
3. Usando pequenas alíquotas (<5 ul) de 0,1 M de Na ₂ CO _3, ajustar o pH da solução de anticorpo para 8,8-9,0. Utilize um papel de pH ou um medidor de pH com uma microeletrodos para monitorar o pH, e ter cuidado para não permitir que o pH a subir acima de pH 9,0.
4. Uma vez que a solução de anticorpo é o pH correcto, adicionar um volume da solução de TCO-NHS correspondentes a 8 equivalentes molares do éster activado. Por exemplo, adicionar 7,9 mL de solução a 1 mg / ml TCO-NHS (1,07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) para 1 ml de solução de 2 mg / mL de anticorpo huA33 (1,33 x 10 ^-8 moles huA33). Não ultrapasse 5% em volume em DMF a solução.
5. Misturar suavemente a solução invertendo o tubo várias vezes microcentrífuga.
6. Enrole o tubo de microcentrífuga em papel de alumínio opaco.
7. Permitir que a solução a incubar durante 1 hr à temperatura ambiente com agitação suave.
8. Após 1 h à temperatura ambiente, purificar o imunoconjugado resultante utilizando um siz descartável pré-embaladoe exclusão coluna de dessalinização. Em primeiro lugar, lavar a coluna de exclusão de tamanho tal como descrito pelo fornecedor para remover quaisquer conservantes presentes na coluna durante o armazenamento. Em seguida, adicione a mistura de reacção para a coluna de exclusão de tamanho, lavar a coluna com 1,5 ml de 0,9% de solução salina estéril, e em seguida recolher o produto utilizando-se 2 ml de solução salina estéril a 0,9%, como o eluente.
   NOTA: Esta etapa irá produzir o concluída huA33-TCO como uma solução de 2 ml.
9. Medir a concentração da resultante huA33-TCO em um espectrofotómetro de UV-Vis.
10. Se uma concentração mais elevada é desejada, concentra-se a solução huA33-TCO utilizando uma unidade de filtração centrífuga com um peso molecular de 50.000 de corte.
    NOTA: É importante observar que enquanto huA33 e uma variedade de outros anticorpos conhecidos (por exemplo, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) são muito tolerantes de ser concentrada, agregação e precipitação pode ocorrer após concentração em outros casos. Pesquisadores de tentar esta procedure com um novo anticorpo deve confiar na literatura ou o seu próprio conhecimento do anticorpo em questão diz respeito à possibilidade ou não de se concentrar o anticorpo.
11. Guardar o imunoconjugado completado huA33-TCO a 4 ° C no escuro.
    NOTA: Este é um ponto de parada aceitável no procedimento. O conjugado mAb TCO preenchido deve ser estável durante pelo menos 3 meses sob estas condições de armazenamento.

3. ⁶⁴ Cu Radiomarcação de Tz-Bn-NOTA

NOTA: Este passo do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos - ou realizar qualquer outro trabalho com radioatividade - pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

1. Num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml, preparar uma solução de Tz-Bn-NOTE 0,5 mg / ml (723 uM).
2. Numa MicroC 1,7 mlentrifuge tubo, adicionar 10 ul da solução Tz-Bn-NOTE (5 ug) a 400 uL de _tampão NH4OAc 0,2 M pH _5,5.
3. No interesse do bom radioquímica nota-keeping, medir e registrar a quantidade de radioactividade na amostra usando um calibrador de dose antes e depois das etapas que se seguiram no protocolo abaixo (3,4-3,8). Isso vai ajudar com a determinação exata da yields radioquímica.
4. Adicionar 2.000 �i (74 MBq) de ⁶⁴ Cu à solução Tz-Bn-NOTA.
   NOTA: Tipicamente, ^[64 Cu] CuCl ₂ é fornecido em um pequeno volume (<30 ul) de HCl 0,1 N, e, por conseguinte, apenas pequenas quantidades (<10 ul) desta solução de estoque são necessários para a reacção de marcação radioactiva. Se forem necessárias maiores volumes do ^[64 Cu] _CuCl2 estoque, a reacção de marcação radioactiva é tolerante de aumentar o volume de reacção total. No entanto, o pH da solução de reacção radiomarcação devem ser cuidadosamente monitorizados para assegurarque ele não caia abaixo de pH 4.0.
5. Permitir que a solução a incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave.
6. Após 10 min de incubação, purificar o produto usando cromatografia de HPLC de fase reversa _C-18. Os tempos de retenção são obviamente altamente dependente da configuração do equipamento de HPLC de cada laboratório (bombas, colunas, tubos, etc). No entanto, para apresentar um exemplo, se um gradiente de 5:95 de MeCN / H ₂ O (ambos com 0,1% de TFA) a 95: 5 de MeCN / _H2O ao longo de 15 min é usada, o tempo de retenção de ⁶⁴ Cu-Tz- Bn-NOTA deve ser em torno de 9,8 min, enquanto livre, não complexada ⁶⁴ Cu eluirá com a frente do solvente em cerca de 2-4 min.
7. Usando um evaporador rotativo, remover o eluente de HPLC.
8. Recolher o produto ^{de 64} Cu-Tz-Bn-NOTA em 0,9% de solução salina estéril.
   NOTA: Tendo em conta a 12,7 h meia-vida física de ⁶⁴ Cu, este não é um ponto de paragem no processo aceitável. Realizar a síntese de ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTUm imediatamente antes da injeção do radioactivo, e siga o passo a passo 3.7 imediatamente 4.5.

4. In Vivo Pretargeted de imagem PET

NOTA: Como no Protocolo Secção 3, esta etapa do protocolo envolve o manuseamento e manipulação de radioactividade. Antes de executar estes passos pesquisadores deve consultar com Radiação Secretaria de Segurança de sua instituição de origem. Tomar todas as medidas possíveis para minimizar a exposição à radiação ionizante.

1. Em um rato nu atímica feminino, implante subcutâneo 1 x 10 células de câncer colorretal ⁶ SW1222 e ​​permitir que estes se transformar em um 100-150 mm ³ heterólogo (9-12 dias após a inoculação) ^11.
2. Dilui-se uma alíquota da solução-huA33 TCO Protocolo de secção 2 para uma concentração de 0,5 mg / ml em 0,9% de solução salina estéril.
3. Injectar 200 ul da solução-huA33 TCO (100 ug) na veia da cauda do rato xenoenxerto de rolamento.
4. Permitir que 24 horas para a acumulação do huA33-TCO no tumor do mouse.
5. Dilui-se a ⁶⁴ de Cu-Tz-Bn-NOTE radioligando para uma concentração de 1,5 mCi / ml em 0,9% de solução salina estéril.
6. Injectar 200 ul da solução de ligando radioactivo ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTE (300 uCi; 11,1; 1,6 MBq de ⁶⁴ nmol de Cu-Tz-Bn-NOTA, assumindo uma actividade especifica de 6,7 MBq / nmol) na veia da cauda do camundongos portadores de xenotransplante.
7. No ponto de tempo de imagem desejada (por exemplo, 2, 6, 12, ou 24 horas após a injecção), anestesiar o rato com uma isoflurano a 2%: mistura de gás oxigénio.
8. Posicione o mouse em cima da cama do pequeno scanner de PET animal. Manter a anestesia durante a varredura usando um isoflurano 1%: mistura de gás oxigênio. Antes de colocar o animal na mesa do scanner, verifique anestesia utilizando o método toe-pitada e aplicar pomada veterinária aos olhos do mouse para evitar o ressecamento durante a anestesia.
9. Adquirir os dados de PET para o mouse através de um estáticodigitalizar com um mínimo de 20 milhões de eventos coincidentes, utilizando uma janela de energia de 350-700 keV e uma janela de tempo coincidência de 6 ns. Depois de concluir a aquisição da imagem, não deixe o mouse autônoma e não colocá-lo em uma gaiola com outros ratos até que recuperou a consciência.

Resultados

Os três primeiros passos da experiência - a síntese de Tz-Bn-NOTA, a conjugação da TCO para huA33, e a marcação radioactiva do Tz-Bn-NOTE construir (Figuras 3 e 4) - são altamente fiáveis. No caso do processo acima descrito, o construto Tz-Bn-NOTE foi sintetizado com elevado rendimento e pureza. O anticorpo foi modificado com huA33 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, e Tz-Bn-NOTE foi marcado radioactivamente com ⁶⁴ Cu, para se obter o radioligando purificada em> 99% de pureza r...

Discussão

A principal vantagem desta estratégia de imagem PET pretargeted é que ele é capaz de delinear com tumores alvo-fundo-de contraste de imagem em apenas uma fracção da dose de radiação de fundo produzida por anticorpos marcados directamente. Por exemplo, no sistema de imagem do cancro colo-rectal descrito aqui, os dados obtidos em experiências de biodistribuição agudas foram utilizados para realizar os cálculos de dosimetria para a estratégia de pré-direccionamento com base de ^Cu-64, juntamente com ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C