רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

בשלושים השנים האחרונות, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הפכה לכלי הכרחי קליני באבחון ובטיפול בסרטן. נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים פולטות פוזיטרונים לגידולים בשל זיקתם המעודנת והספציפיות לסמנים לסרטן. ^1,2 הפרמקוקינטיקה עם זאת, איטית יחסית in vivo של נוגדנים מחייבת שימוש ברדיואיזוטופים עם multi-יום מחצית חיים פיזיים. שילוב זה יכול להניב מינוני קרינה גבוהה לאיברים שאינם היעד של חולים, סיבוך חשוב שיש משמעות קלינית בפרט מאז radioimmunoconjugates מוזרק לוריד ולכן - בניגוד סריקות CT הגוף חלקיים - תוצאה במינונים שקועים בכל חלק של הגוף, ללא קשר לרקמות נחקרו.

כדי לעקוף בעיה זו, מאמץ משמעותי הוקדשה לdevelopment של אסטרטגיות ההדמיה PET שלנתק את הרדיו-איזוטופי ומחצית המיקוד, וכך למנף את מאפייני יתרון של נוגדנים תוך עוקפים בו-זמנית מגבלות pharmacokinetic הפנימיות שלהם. אסטרטגיות אלה - לרוב מכונות pretargeting או מיקוד רב שלבי - בדרך כלל להעסיק ארבעה שלבים: (1) מתן נוגדן מסוגל להיקשר גם אנטיגן וradioligand; ההצטברות של הנוגדן ברקמת המטרה והפינוי שלה מהדם (2); (3) הניהול של radioligand מולקולה קטנה; ו- (4) קשירת in vivo של radioligand לנוגדן ואחרי הפינוי המהיר של radioligand העודף. ^3-8 בחלק מהמקרים, סולק נוסף מוזרקת בין השלבים 2 ו -3 כדי להאיץ את ההפרשה של כל נוגדן שעדיין לא מחייבים את הגידול ונשאר בדם. ⁵

באופן כללי, twסוגי o אסטרטגיות pretargeting הם נפוצים ביותר בספרות. בעוד שני הוכיחו מוצלחים במודלים פרה, הם גם בעלי מגבלות עיקריות שמנעו היישום הקליני שלהם. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הזיקה הגבוהה בין נוגדני streptavidin מצומדות- וradiolabels-שונה ביוטין; עם זאת, immunogenicity של הנוגדנים-שונה streptavidin הוכיח להיות בעיה מדאיגה בכל קשור לתרגום. ^5,6,9,10 האסטרטגיה השנייה, לעומת זאת, מעסיקה נוגדני bispecific כי כבר-מהונדס גנטי כדי לאגד את שני סרטן אנטיגן הסמן הביולוגי וhapten radiolabeled מולקולה קטנה. ^3,11-14 בעוד המסלול אחרון זה בהחלט יצירתי, תחולתו הרחבה הוא מוגבלים על ידי מורכבות, חשבון, וחוסר המודולריות של המערכת.

לאחרונה, פיתחנו ופרסמנו מתודולוגיה ההדמיה PET pretargeted מבוססים על ביקוש האלקטרון ההפוך דילס-Alder (אניאדה) תגובת cycloaddition בין -cyclooctene טרנס (TCO) וtetrazine (טז;. איור 1) ¹¹ בעוד התגובה עצמו כבר ידוע במשך עשרות שנים, הכימיה IEDDA חוותה רנסנס בשנים האחרונות כטכניקת bioconjugation כימיה לחץ, כפי שמודגם על ידי העבודה המרתקת של הקבוצות של ראלף Weissleder, יוסף פוקס, ופיטר Conti בין יתר. ^12-15 cycloaddition IEDDA יושם במגוון רחב של הגדרות, כולל הדמיה הקרינה עם פפטידים, נוגדנים, וחלקיקים, כמו גם הדמיה גרעינית . עם שני radiohalogens וradiometals ^16-26 קשירה היא גבוהה מניב, נקייה, מהירה (k _1> 30,000 M ^-1 שניות ^-1), סלקטיבי, ו-- ביקורתי -. Bioorthogonal ²⁷ ובעוד מספר סוגים של כימיה לחץ - כולל cycloadditions-זרז Cu-אזיד alkyne, cycloadditions אזיד-alkyne-קידם מתח, וStaudinger ligations -. גם הוא bioorthogonal, זה שילוב הייחודי של קינטיקה מהירה תגובה וbioorthogonality שעושה כימיה IEDDA גם כך מתאים לpretargeting יישומים בכל האורגניזמים ^28,29 לאורך שורות אלה, חשוב לשים לב כי לאחרונה דווח משלנו מעבדות לא היו הראשונה ליישם כימיה IEDDA לpretargeting: הדו"ח הראשון של הדמיה pretargeted עם IEDDA נבעו מהעבודה של Rossin, et al והשתתפות מתודולוגיה SPECT העסקת ¹¹¹ tetrazine שכותרתו ב- ^30..

כפי שהזכרנו לעיל, יש מתודולוגיה pretargeting ארבעה צעדים פשוטים למדי (איור 2). בפרוטוקול ביד, אסטרטגית pretargeted להדמית PET של סרטן מעי גס שמעסיקה radioligand ⁶⁴ שכותרתו Cu-NOTA tetrazine והמצומד שונה-TCO של נוגדן huA33 תתואר. עם זאת, בסופו של המודולריות של מתודולוגיה זו היא אחת מגרנכסי eatest, כמחצית -cyclooctene טרנס יכולים להיות מצורפים לכל נוגדן שאינה הפנמה, וtetrazine יכול להיות מחובר למגוון רחב של כתבים רדיואקטיביים.

Protocol

מסר של אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. סינתזה של TZ-BN-NOTA

1. בכלי תגובה קטנים, לפזר 7 מ"ג NH ₂ -Bn-NOTA (1.25 x 10 ^-2 mmol) ב600 NaHCO ₃ חיץ μl (0.1 מ ', pH 8.1). בדוק את ה- pH של התמיסה. במידת צורך, להתאים את ה- pH של התמיסה ל -8.1 באמצעות aliquots הקטן של 0.1 M Na ₂ CO _3.
2. מוסיף את פתרון -Bn-NOTA NH ₂ ל -0.5 מ"ג TZ-NHS (1.25 x 10 ^-3 mmol) בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge.
   הערה: אם אפשר לשקול TZ-NHS החוצה יבש או הגיע מפתרון מניות של DMF היבש או DMSO (<50 μl).
3. אפשר פתרון התגובה וכתוצאה מכך להגיב למשך 30 דקות ב RTעם תסיסה עדינה.
4. לאחר 30 דקות, לטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב כרומטוגרפיה ₁₈ HPLC C כדי להסיר NH unreacted ₂ -Bn-נוטה. ניתן לנטר NH ₂ -Bn-NOTA באורך גל של 254 ננומטר, ואילו TZ-NHS וTZ-BN-NOTA נמצאים תחת פיקוח הטוב ביותר באורך גל של 525 ננומטר.
   הערה: זמני שייר הם כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו '). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 0: 100 MeCN / H ₂ O (שניהם עם 0.1% TFA) 100: 0 MeCN / H ₂ O מעל 25 דקות ועמודת 4.6 x 250 מ"מ C ₁₈ אנליטיות משמש , הפעמים השמירה של TZ-BN-נוטה, TZ-NHS, וNH ₂ -Bn-NOTA יהיו סביב 15 דקות, 16.5 דקות, 10 דקות ו, בהתאמה. המוצר יכול להיות מטוהר ממרכיבי תגובה האחרים באו ריצה אחת או ריצות מרובות באמצעות טור HPLC למחצה preparative או preparative C _18. ¹ H-NMR, אנאליytical HPLC, וESI-MS כל השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לאמת את טוהר של מבשר TZ-BN-NOTA הושלם. ¹¹
5. להקפיא את eluent HPLC נאסף באמצעות חנקן נוזלי.
6. לעטוף את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום אטום.
7. מניחים את צינור איסוף הקפוא בO כלי lyophilizing / N כדי להסיר את השלב הנייד HPLC.
8. אחסן את המוצר המטוהר (ורוד בהיר מוצקה) בחושך ב -80 ° C.
   הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. מבשר TZ-BN-NOTA הושלם הוא יציב במשך לפחות 1 שנה בתנאים אלה.

2. הכנת huA33-TCO Immunoconjugate

1. בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 1 מ"ג / מיליליטר (2.7 מ"מ) פתרון של TCO-NHS בDMF היבש.
2. בתוך צינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge, להכין 2 מ"ג / מיליליטר פתרון (13.3 מיקרומטר) של huA33 ב 1 מיליליטר של בופר פוספט, pH 7.4 (0.01 M ₄ PO ^_3, 0.154 M NaCl).
3. באמצעות aliquots הקטן (<μl 5) של 0.1 M Na ₂ CO _3, להתאים את ה- pH של תמיסת הנוגדן ל8.8-9.0. השתמש באחת נייר pH או מטר pH עם microelectrode לפקח pH, ולהיזהר שלא לאפשר את ה- pH להתעלות מעל pH 9.0.
4. לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון TCO-NHS המקביל ל 8 שווה טוחנת של אסתר הופעלה. לדוגמא, להוסיף 7.9 μl של 1 מ"ג הפתרון / מיליליטר TCO-NHS (1.07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) למ"ל 1 של פתרון 2 מ"ג / מיליליטר נוגדן huA33 (1.33 x 10 ^-8 mol huA33). לא יעלה על 5% DMF לפי נפח בפתרון.
5. לערבב בעדינות את הפתרון על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים.
6. לעטוף את צינור microcentrifuge ברדיד אלומיניום אטום.
7. אפשר הפתרון לדגירה עבור שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה.
8. אחרי השעה 1 בRT, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות siz חד פעמי מראש ארזהדרת דואר טור desalting. ראשית, יש לשטוף את עמודת הדרת גודל כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל חומרים משמרים נוכחי בעמודה במהלך האחסון. לאחר מכן, מוסיף את תערובת התגובה לטור הדרת גודל, לשטוף את הטור עם 1.5 מיליליטר 0.9% תמיסת מלח סטרילית, ולאחר מכן לאסוף את המוצר באמצעות 2 מיליליטר של 0.9% תמיסת מלח סטרילית כeluent.
   הערה: שלב זה יניב huA33-TCO הושלם כפתרון 2 מיליליטר.
9. למדוד את הריכוז של התוצאה huA33-TCO על UV-Vis ספקטרופוטומטר.
10. אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, לרכז את פתרון huA33-TCO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי.
    הערה: חשוב לציין כי בעוד huA33 ומגוון של נוגדנים אחרים ידועים (למשל, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, וJ591) הם סובלניים מאוד להיות מרוכז, וצבירת משקעים יכולים להתרחש על ריכוז במקרים אחרים. חוקרים מנסים זה procedיור עם נוגדן חדש צריך לסמוך על הספרות או הידע שלהם של הנוגדנים בשאלה בנוגע לשאלה האם לא להתרכז הנוגדן.
11. אחסן את immunoconjugate huA33-TCO הושלם על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
    הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. המצומד מב-TCO השלים צריכה להיות יציב במשך לפחות 3 חודשים בתנאי האחסון הללו.

3. ⁶⁴ Cu Radiolabeling של TZ-BN-NOTA

הערה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים - או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות - חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

1. בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 0.5 מ"ג / מיליליטר (723 מיקרומטר) פתרון של TZ-BN-נוטה.
2. בmicroc 1.7 מיליליטרצינור entrifuge, להוסיף 10 μl של פתרון TZ-BN-NOTA (5 מיקרוגרם) 400 μl של 0.2 M NH ₄ OAC pH 5.5 _חיץ.
3. בעניין של פתק שמירת radiochemical הנכונה, למדוד ולתעד את כמות הרדיואקטיביות במדגם באמצעות כיל מנה לפני ואחרי הצעדים שהתפתחו בפרוטוקול בהמשך (3.4-3.8). זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical.
4. להוסיף 2,000 μCi (74 MBq) של ⁶⁴ Cu לפתרון TZ-BN-נוטה.
   הערה: בדרך כלל, ^[64 Cu] CuCl ₂ מסופקת בנפח קטן (<30 μl) של 0.1 N HCl, ובכך רק בנפחים קטנים (<10 μl) של פתרון מניות זו נדרשות לתגובת radiolabeling. אם בכמויות גדולות של המניות ^[64 Cu] CuCl ₂ יש צורך, תגובת radiolabeling היא סובלנית של הגדלת נפח התגובה הכוללת. עם זאת, ה- pH של תמיסת תגובת radiolabeling צריך להיות במעקב צמוד כדי להבטיחשזה לא יפחת מ pH 4.0.
5. אפשר הפתרון לדגירה של 10 דקות ב RT עם תסיסה עדינה.
6. לאחר 10 דקות של דגירה, לטהר את המוצר באמצעות C ₁₈ כרומטוגרפיה HPLC ההפוך-שלב. פעמים שמירה הן כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו '). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 5:95 MeCN / H ₂ O (שניהם עם 0.1% TFA) 95: 5 MeCN / H ₂ O מעל 15 דקות משמש, זמן השמירה של ⁶⁴ Cu-Tz- BN-NOTA צריך להיות סביב 9.8 דקות בזמן חופשי, ⁶⁴ Cu uncomplexed יהיה elute עם חזית הממס בסביבות 2-4 דקות.
7. באמצעות מאייד סיבובי, להסיר את eluent HPLC.
8. Redissolve מוצר ⁶⁴ Cu-טז-BN-NOTA בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
   הערה: בהתחשב 12.7 שעות זמן מחצית החיים הפיזיים של ⁶⁴ Cu, זה לא נקודת עצירה מקובלת בהליך. לבצע הסינתזה של ⁶⁴ Cu-טז-BN-לאמייד לפני ההזרקה של radioligand, ובצעו את שלב 3.7 מייד אחר צעד 4.5.

4. בVivo Pretargeted PET הדמיה

הערה: כמו בסעיף 3 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

1. בעכבר נקבת athymic בעירום, שתל תת עורי 1 x 10 תאי סרטן מעי גס ⁶ SW1222 ולאפשר לגדול אלה לתוך xenograft 100-150 מ"מ ³ (9-12 ימים לאחר חיסון). ¹¹
2. לדלל aliquot של פתרון huA33-TCO מפרוטוקול סעיף 2 לריכוז של 0.5 מ"ג / מיליליטר בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
3. להזריק 200 μl של פתרון huA33-TCO (100 מיקרוגרם) לוריד הזנב של עכבר xenograft נושאות.
4. לאפשר 24 שעות לצבירת huA33-TCO בגידול של העכבר.
5. לדלל את radioligand Cu-טז-BN-NOTA ⁶⁴ לריכוז של 1.5 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
6. להזריק 200 μl של פתרון ⁶⁴ Cu-טז-BN-NOTA radioligand (300 μCi; 11.1 MBq; 1.6 nmol של ⁶⁴ Cu-טז-BN-נוטה, בהנחת פעילות ספציפית של 6.7 MBq / nmol) לוריד הזנב של עכברי נושאי xenograft.
7. בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 2, 6, 12, או 24 שעות לאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן.
8. מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן. לשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ ולהחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה.
9. לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סטטילסרוק עם מינימום של 20 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה.

תוצאות

שלושה שלבים הראשוניים של הניסוי - הסינתזה של TZ-BN-נוטה, נטיה של TCO לhuA33, וradiolabeling של TZ-BN-NOTA לבנות (איורים 3 ו -4) - הם אמין ביותר. במקרה של ההליך הנ"ל, מבנה TZ-BN-NOTA היה מסונתז בתשואה גבוהה וטוהר. נוגדן huA33 היה שונה עם 4.2 ± 0.6 TCO / מב, וTZ-BN-NOTA היה radiolabeled עם ⁶⁴ Cu ...

Discussion

היתרון העיקרי של אסטרטגית ההדמיה PET pretargeted הזה הוא שהוא מסוגל התוויית גידולים עם ניגודיות תמונת יעד לרקע בחלק קטן בלבד של מינון קרינת רקע המיוצר על ידי נוגדנים שכותרתו ישירות. לדוגמא, במערכת ההדמיה סרטן המעי הגס שתוארה כאן, נתונים מניסויי biodistribution חריפים הועסקו כדי לב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C