プレターゲッティングPETイメージング用バイオ直交逆電子需要ディールスアルダー環化を活用

要約

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

要約

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

概要

最後の30年間で、陽電子放射断層撮影（PET）は、癌の診断と管理に不可欠な臨床ツールとなっている。抗体は、長い癌バイオマーカーに対するそれらの絶妙な親和性および特異性に起因する腫瘍への陽電子放出放射性同位元素の送達のための有望なベクターであると考えられている。抗体の^1,2-しかしながら、比較的遅いインビボでの薬物動態は、複数日と放射性同位元素の使用を義務付け物理的半減期。この組み合わせは、患者の非標的器官、放射性免疫複合体を静脈内、したがって注入されるので、特定の臨床的意義のある重要な合併症に高い放射線量を得ることができる - 部分ボディCTスキャンとは異なり - 身体のあらゆる部分に吸収線量をもたらす、尋問組織の関係なく。

この問題を回避するためには、かなりの努力がdeveloに専念してきました同時に、それらの固有の薬物動態学的限界を幅木つつ抗体の有利な特性を活用し、放射性同位体と標的部分を切り離すPETイメージング戦略のpment。これらの戦略は-最も頻繁にプレターゲッティングまたは多段階のターゲティングと呼ばれる- 典型的には4つのステップを使用する：（1）抗原および放射性リガンドの両方に結合することができる抗体を投与する。 （2）標的組織及び血液からのそのクリアランスにおける抗体の蓄積。 （3）小分子、放射性リガンドを投与する。 （4）過剰な放射性リガンドの迅速なクリアランスによって。場合によっては^3-8続い抗体に対する放射性リガンドのインビボでの連結は、追加のクリアリング剤は、任意の抗体の排泄を促進するために、手順2と3の間に注入されるそれは、腫瘍をバインドするためにまだあり、血液中に残っている^。5

広義には、TWを話すプレターゲッティング戦略のO型は、文学の中で最も普及している。両方の前臨床モデルで成功を収めているが、それらはまた、それらの臨床適用を妨げている重要な制限を有する。最初の戦略は、ストレプトアビジン結合抗体およびビオチン修飾放射標識の間に高い親和性に依存しています。しかし、ストレプトアビジンで修飾された抗体の免疫原性は、翻訳に関して気になる問題があることが証明されている。 ^{メタノシクロオクタ}第二の戦略は、対照的に、癌の両方に結合するように遺伝子操作された二重特異性抗体を用いてバイオマーカー抗原と小分子、放射性標識ハプテン^。3,11-14この後者のルートは確かに創造的である一方、その広範な適用は複雑さ、費用、およびシステムのモジュール性の欠如によって制限されている。

最近、我々は、逆電子需要ディールス - アルダーに基づくプレターゲッティングPET画像化方法論を開発し、公開された（Iトランス -cyclooctene（TCO）とテトラジン（Tzの間EDDA）付加環化反応; 図^1）11反応自体は何十年も知られているがで示されるように、IEDDA化学は、クリック化学バイオコンジュゲーション技術として、近年、ルネッサンスを経験しているとりわけラルフ·ワスリーダー、ジョセフ·フォックス、そしてピーター·コンティのグループの魅力的な作品^。12-15 IEDDAの環は、蛍光ペプチドでのイメージング、抗体、およびナノ粒子だけでなく、核画像を含め、設定の広い範囲で適用されている。批判- -バイオ直交²⁷とクリックケミストリーの種類数ながら。放射性ハロゲンと放射性金属の両方で^16-26ライゲーションは高い収穫、清潔、迅速な（K _1>3万M ^-1秒^-1）、選択され、 -銅触媒によるアジド - アルキン付加環、ストレイン·昇格アジド - アルキン付加環、及びシュタウディンガーLIG含む管理ポイント- 。それは生物全体でアプリケーションをプレターゲッティングに適しとてもよくIEDDA化学を行い、反応速度が速くとbioorthogonalityのユニークな組み合わせであるだけでなく、バイオ直交であるこれらの線に沿って^28,29、それがあることを私たちの最近の報告に注意することが重要である研究所は、プレターゲッティングにIEDDA化学を適用することが第一ではなかった：IEDDAと予め標的イメージングの最初の報告は、 ら Rossin、の仕事から生じたと¹¹¹ In標識テトラジンを採用したSPECTの方法論を特色にした^30。。

我々は、上述のように、プレターゲッティング方法は、4つの非常に単純な手順（ 図2）を有している。手元プロトコルでは^、64のCu-NOTA標識テトラジン放射性リガンド及びhuA33抗体のTCO変性共役を用いた結腸直腸癌のPET画像化のためのプレターゲッティング戦略を説明する。しかし、最終的にはこの方法論のモジュールは、そのGRの一つですトランス -cyclooctene部分としてeatest資産は、非内在化抗体に付加することができ、テトラジン、放射性レポーターの多種多様に取り付けることができる。

プロトコル

倫理STATEMENT：記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。

TZ-BN-NOTAの1の合成

1. 小さ ​​な反応容器中で、600μlの飽和NaHCO ₃緩衝液（0.1M、pHが8.1）に7mgのNH ₂ -Bn-NOTA（1.25×10 ^-2ミリモル）を溶解する。溶液のpHを確認してください。必要に応じて、0.1 MのNa ₂ CO ₃の少量のアリコートを用いて8.1に溶液のpHを調節する。
2. 1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに0.5mgのTZ-NHS（1.25×10 ^-3 mmol）のNH ₂ -Bn-NOTAソリューションを追加します。
   注：TZ-NHSは、乾式を秤量または乾燥DMFまたはDMSO（<50μL）のストック溶液から追加することができます。
3. 得られた反応溶液を室温で30分間反応させる穏やかに撹拌しながら。
4. 30分後、未反応のNH ₂ -Bn-NOTAを除去し、逆相C ₁₈ HPLCクロマトグラフィーを用いて生成物を精製する。 TZ-NHSおよびTZ-BN-NOTAは最高の525の波長で監視されながら、NH ₂ -Bn-NOTAは、254nmの波長でモニターすることができます。
   注：保持時間は、明らかに、各研究室（ポンプ、カラム、チューブなど ）のHPLC機器設定に大きく依存している。 100〜100のMeCN / H ₂ O（0.1％TFA両方）：0のMeCN / H ₂ O 25分および分析4.6×250ミリメートルC ₁₈カラムを使用した0の勾配は場合は、例を提示する、Tzを-Bnは、NOTA、Tzを-NHSおよびNH ₂ -Bn-NOTAの保持時間は、それぞれ、約15分、16.5分、および10分であろう。生成物は、単一の実行またはセミ分取または分取C ₁₈ HPLCカラムを使用して複数の実行のいずれかの他の反応成分から精製することができる^。1 H-NMR、肛門ytical HPLCおよびESI-MS完了Tzを-Bnは、NOTA前駆体の純度を確認するために使用することができるすべての方法である^。11
5. 液体窒素を使用して収集HPLC溶出液を凍結する。
6. 不透明なアルミホイルで凍結されたコレクションチューブを包みます。
7. HPLC移動相を除去するために凍結乾燥容器のO / Nで凍結されたコレクションチューブを置きます。
8. -80℃で暗所に精製された生成物（固体明るいピンク）を保管してください。
   注：この手順で許容停止点である。完成Tzを-Bnは、NOTA前駆体は、これらの条件下で少なくとも1年間安定である。

huA33-TCO免疫複合の調製

1. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、1 mg / mlの乾燥DMF中のTCO-NHSの（2.7 mM）の溶液を調製。
2. _1.7 mlのマイクロ遠心チューブにおいて、リン酸緩衝生理食塩水1mlにhuA33の2mg / mlの（13.3μM）溶液を調製し、pHを7.4（0.01 M PO ₄ ^3- 0.154 MのNaCl）。
3. 0.1 MのNa ₂ CO ₃の少量のアリコート（<5μl）を使用して、8.8から9.0への抗体溶液のpHを調整。 pHを監視するために微小電極でpH試験紙またはpH計のいずれかを使用し、pHが9.0を超えて上昇することを可能にしないように注意してください。
4. 抗体溶液は、適切なpHであると、活性化エステルの8モル当量に対応するTCO-NHS溶液の容量を追加する。例えば、2 mg / mlのhuA33抗体溶液（1.33×10 ^-8モルhuA33）1mlに1mg / mlのTCO-NHSの溶液（1.07×10 ^-7モルTCO-NHS）7.9μlを添加する。溶液中で5体積％DMFを超えないようにしてください。
5. 静かにマイクロ遠心チューブを数回反転させた溶液を混合。
6. 不透明なアルミホイルでマイクロ遠心チューブを包みます。
7. ソリューションは、穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートすることを許可する。
8. 室温で1時間後、プレパック使い捨てSIZを使用して生じた免疫複合体を精製しE除外脱塩カラム。貯蔵中のカラム上に存在する任意の防腐剤を除去するために供給者によって記載されているように、まず、サイズ排除カラムをリンスする。その後、1.5mlの0.9％滅菌生理食塩水でカラムを洗い流し、サイズ排除カラムに反応混合物を追加し、続いて溶離液として0.9％滅菌生理食塩水2 mlを使用して製品を収集する。
   注：このステップは2ミリリットルソリューションとして完成huA33-TCOが得られます。
9. UV-Vis分光光度計に生じたhuA33-TCOの濃度を測定します。
10. より高い濃度が望まれる場合には50,000分子量カットオフ遠心フィルターユニットを用いhuA33、TCO液を濃縮する。
    注：それはhuA33と他のよく知られた種々の抗体（ 例えば、ベバシズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、およびJ591）が集中しているのは非常に寛容である一方で、凝集および沈殿が他のケースでは濃度に発生する可能性があることに注意することが重要である。このPROCEDを試みる研究者新しい抗体とのUREは文献または抗体を集中させるかどうかに関しては問題の抗体の独自の知識を信頼する必要があります。
11. 暗闇の中で4℃で完了しhuA33-TCOの免疫複合体を保管してください。
    注：この手順で許容停止点である。完成したmAbを、T​​COコンジュゲートは、これらの保存条件下で少なくとも3ヶ月間安定であるべきである。

3. TZ-BN-NOTAの⁶⁴ Cuの放射性標識

注：プロトコルのこの手順では、放射能の取り扱いと操作を含む。または放射能を持つ他の作業を行う - - これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるために可能なすべての手順を実行します。

1. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、0.5 mg / mlの（723μM）TZ-BN-NOTAの溶液を調製。
2. 1.7ミリリットルのMicroCでentrifugeチューブ、0.2 M NH ₄ OAcのpHが5.5の緩衝液400μlにTZ-BN-NOTA溶液10μl（5μgの）を追加します_。
3. 適切な放射化学ノートキーピングの利益のために、以下のプロトコル（3.4から3.8）でその後の工程の前と後の投与量キャリブレータを用いて試料中の放射能の量を測定し、記録します。これは放射化学的収率での正確な決定に役立ちます。
4. TZ-BN-NOTA溶液に⁶⁴のCuの2000μCiの（74 MBqの）を追加します。
   注：典型的には^、[64のCu]のCuCl _2を 0.1NのHClの小体積（<30μlの）で供給されるので、この原液のほんの体積（<10μl）を、放射標識反応のために必要とされる。 ^【64のCu]のCuCl ₂株式の大きなボリュームが必要な場合は、放射標識反応は、全反応容積を増大は許容される。しかし、放射性標識反応液のpHを確保するために注意深く監視されるべきであるそれはpHが4.0を下回らないこと。
5. ソリューションは、穏やかに撹拌しながら室温で10分間インキュベートすることを許可する。
6. インキュベーションの10分後、逆相C ₁₈ HPLCクロマトグラフィーを用いて生成物を精製する。保持時間は、明らかに、各研究室（ポンプ、カラム、チューブなど ）のHPLC機器設定に大きく依存している。 ⁶⁴のCu-Tz-の保持時間、分が使用されている15以上5のMeCN / H ₂ O：95から5:95のMeCN / H ₂ O（0.1％TFAの両方）の勾配場合は、例を提示する無料で、非複合体⁶⁴ Cuが周りに2-4分で溶媒先端で溶出する一方BN-NOTAは約9.8分であるべきである。
7. ロータリーエバポレーターを用いて、HPLCの溶離液を取り除く。
8. 0.9％滅菌生理食塩水で⁶⁴のCu-TZ-BN-NOTA製品を再溶解。
   注^：64のCuの12.7時間の物理的半減期を考えると、これは手続きで許容停止点ではありません。 ⁶⁴のCu-TZ-BN-NOTの合成を行う放射性リガンドの注射の直前に、ステップ4.5によってすぐにステップ3.7に従ってください。

生体内 、プレターゲッティングPETイメージング4.

注：プロトコルセクション3のように、プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるために可能なすべての手順を実行します。

1. 雌の無胸腺ヌードマウス、皮下インプラント1×10 ⁶ SW1222大腸癌細胞における、これらは（9-12日接種後）100〜150ミリメートル³異種移植片へと成長することができます^。11
2. 0.9％滅菌生理食塩水で0.5 mg / mlの濃度にプロトコル部2からhuA33-TCO溶液のアリコートを希釈する。
3. 異種移植片担持マウスの尾静脈にhuA33、TCO溶液200μl（100μgの）を注入する。
4. マウスの腫瘍におけるhuA33-TCOの蓄積のための24時間を許可する。
5. 0.9％滅菌生理食塩水で1.5 mCiの/ mlの濃度になるように⁶⁴のCu-Tzを-Bnは、NOTAの放射性リガンドを希釈する。
6. の尾静脈に（6.7 MBqで/ナノモルの比活性を仮定して^、64のCu-TZ-BN-NOTAの1.6ナノモル; 11.1 MBqの300μCiの^）64のCu-TZ-BN-NOTAの放射性リガンド溶液200μlを注入異種移植片担持マウス。
7. 酸素ガス混合物：所望の撮影時点（ 例えば、2、6、12、または24時間後に注射）で、2％イソフルランでマウスを麻酔。
8. 小動物PETスキャナーのベッドの上にマウスを置きます。酸素ガス混合物：1％イソフルランを使用して、スキャン中に麻酔を維持。スキャナベッド上に動物を配置する前に、つま先ピンチ方式を使用して麻酔を確認し、麻酔中の乾燥を防止するために、マウスの眼に獣医軟膏を適用する。
9. 静的介してマウス用PETデータを取得する350〜700 keVのエネルギーウィンドウと6ナノ秒の一致タイミングウィンドウを使用して2000万一致するイベントを最小限に抑えてスキャンします。画像の取得を完了した後、無人のマウスを残していないし、それが意識を取り戻したまで他のマウスとケージに入れないでください。

結果

実験の最初の三つのステップ- TZ-BN-NOTA、huA33にTCOの結合の合成、およびTZ-BN-NOTAの放射性標識（ 図3、図4）を構築は-信頼性が高いです。上記の手順の場合には、Tzを-Bnは、NOTA構築物を高収率および高純度で合成した。 〜huA33抗体は4.2±0.6、TCO / mAbで変更された、とTZ-BN-NOTAは、> 85％の減衰補正後の収量、および比活性> 99％の放射化学的純度に精製された放射性リガンドを得る?...

ディスカッション

このプレターゲッティングPETイメージング戦略の主な利点は、直接標識された抗体によって生成バックグラウンド放射線量のほんの一部で標的対バックグラウンド画像コントラストを有する腫瘍の輪郭を描くことが可能であることである。例えば、ここに記載の結腸直腸癌のイメージングシステムにおいて、急性生体内分布実験からのデータは、直接標識された⁶⁴のCu-NOTA-huA33 ⁸⁹

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C