Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Zusammenfassung

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Zusammenfassung

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Einleitung

Im Laufe der letzten dreißig Jahre, Positronenemissionstomographie (PET) ist ein unverzichtbares klinisches Werkzeug bei der Diagnose und Behandlung von Krebs. Antikörper werden seit langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Positronen emittierende Radioisotope zu Tumoren durch ihre vorzügliche Affinität und Spezifität für-Biomarkern. ^1,2 jedoch die relativ langsame in vivo pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörpern sieht die Verwendung von Radioisotopen mit mehrtägiges physikalische Halbwertszeiten. Im Gegensatz zu Teilkörper-CT-Scans - - in Energiedosen in jedem Teil des Körpers Ergebnis Diese Kombination kann hohe Strahlendosen auf die Nichtzielorgane von Patienten, eine wichtige Komplikation, die von besonderer klinischer Bedeutung ist, da Radioimmunkonjugate intravenös injiziert und damit ergeben unabhängig von den abgefragten Geweben.

Um dieses Problem zu umgehen, hat erhebliche Anstrengungen unternommen worden, um die develo gewidmetpment der PET-Bildgebung Strategien, die die Radioisotops und der Targeting-Einheit zu entkoppeln, wodurch die Nutzung der vorteilhaften Eigenschaften von Antikörpern und gleichzeitig Sockel ihrer intrinsischen pharmakokinetischen Einschränkungen. Diese Strategien - am häufigsten genannt Pretargeting oder mehrstufige Targeting - typischerweise vier Schritte: (1) die Verabreichung eines Antikörpers, der zur Bindung sowohl ein Antigen und ein Radioligand; (2) die Anreicherung des Antikörpers in das Zielgewebe und seine Clearance aus dem Blut; (3) die Verabreichung eines kleinen Moleküls Radioligand; und (4) die in vivo-Ligation des Radioliganden an den Antikörper, gefolgt durch die schnelle Clearance von überschüssigem Radioligand. ^3-8 In einigen Fällen kann ein zusätzlicher Klärungsmittel zwischen den Schritten 2 und 3, um die Ausscheidung von jedem Antikörper beschleunigen spritzt Dazu ist es noch, den Tumor zu binden und im Blut bleibt. ⁵

Im Großen und Ganzen two Arten von Pretargeting Strategien sind besonders häufig in der Literatur. Während beide erfolgreich in präklinischen Modellen nachgewiesen, sie besitzen auch Schlüssel Einschränkungen, die ihre klinische Anwendbarkeit behindert haben. Die erste Strategie beruht auf der hohen Affinität zwischen Streptavidin-konjugierte Antikörper und Biotin-modifizierten Radiomarkierungen; jedoch die Immunogenität der Streptavidin-modifizierten Antikörper erwies sich eine beunruhigende Problem hinsichtlich der Übersetzung sein. ^5,6,9,10 Die zweite Strategie, die im Gegensatz dazu verwendet bispezifischen Antikörpern, die genetisch manipuliert wurden, um sowohl eine Krebs binden Biomarker Antigen und ein kleines Molekül radiomarkierten Haptens. ^3,11-14 Während dieser letztere Weg ist sicherlich kreativ, wird ihre breite Anwendbarkeit durch die Komplexität, die Kosten und die fehlende Modularität des Systems begrenzt.

In letzter Zeit entwickelt und veröffentlicht eine pretargeted PET Methodik, die auf dem inversem Elektronenbedarf Diels-Alder (I wirEDDA) Cycloaddition zwischen trans -Cycloocten (TCO) und Tetrazin (Tz;. Abbildung 1) ¹¹ Während der Reaktion selbst ist seit Jahrzehnten bekannt, hat IEDDA Chemie eine Renaissance in den letzten Jahren als Klick-Chemie Biokonjugation Technik erlebt, wie dargestellt die faszinierende Arbeit der Gruppen von Ralph Weissleder, Joseph Fox und Peter Conti unter anderem. ^12-15 Die IEDDA Cycloaddition wurde in einer Vielzahl von Einstellungen angewendet wurden, einschließlich Fluoreszenz-Imaging mit Peptiden, Antikörpern, und Nanopartikel sowie die nuklearmedizinische Bildgebung . mit beiden Radiohalogene und Radiometalle ^16-26 Die Ligation ist ertragreiche, saubere, schnelle (k _1> 30000 M ^-1 s ^-1), selektiver und - entscheidend -. bioorthogonale ²⁷ Und während eine Reihe von Arten von Klick-Chemie - einschließlich Cu-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition, spannungskatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition und Staudinger ligtionen -. sind bioorthogonale als gut, es ist die einzigartige Kombination von schnellen Reaktionskinetik und Bioorthogonalität die IEDDA Chemie macht so gut geeignet, um Pretargeting Anwendungen in ganzen Organismen ^28,29 In diesem Sinne ist es wichtig zu beachten, dass dem jüngsten Bericht von unserem Labors war nicht der erste, IEDDA Chemie Pretargeting gelten: der erste Bericht über pretargeted Bildgebung mit IEDDA entstand aus der Arbeit von Rossin, et al und enthielt eine SPECT Methodik unter Verwendung einer ¹¹¹ In-markierten Tetrazin ^30..

Wie wir oben diskutiert, hat der Pretargeting Methodik vier ziemlich einfachen Schritten (Abbildung 2). In dem Protokoll zur Hand, wird ein pretargeted Strategie für die PET-Bildgebung von Darmkrebs, der eine ⁶⁴ Cu-NOTA-markierten Tetrazin Radioliganden und einem TCO-modifizierte Konjugat des Antikörpers huA33 beschäftigt beschrieben werden. Ist einer seiner gr jedoch letztendlich die Modularität dieser Methodikißt Vermögen als trans -Cycloocten Rest kann ein beliebiges nicht-internalisierenden Antikörper angehängt werden, und das Tetrazin kann auf eine Vielzahl von radioaktiven Reporter befestigt werden.

Protokoll

ETHIK STATEMENT: Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Synthese von Tz-Bn-NOTA

1. In einem kleinen Reaktionsgefß löst man 7 mg NH ₂ -Bn-NOTA (1,25 x 10 ^-2 mmol) in 600 & mgr; l NaHCO ₃ Puffer (0,1 M, pH 8,1). Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung. Falls erforderlich, den pH-Wert der Lösung einzustellen, um 8.1 mit kleinen Aliquots von 0,1 M Na ₂ CO _3.
2. Füge das NH ₂ -Bn-NOTA Lösung auf 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 ^-3 mmol) in einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Tz-NHS kann entweder trocken gewogen oder aus einer Stammlösung trockenem DMF oder DMSO (<50 ul) hinzugefügt werden.
3. Ermöglichen die erhaltene Reaktionslösung für 30 min bei RT reagierenunter leichtem Rühren.
4. Nach 30 min reinigen Sie das Gerät mit _{Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie,} um nicht umgesetztes NH ₂ Bn-NOTA entfernen. Die NH ₂ -Bn-NOTA kann bei einer Wellenlänge von 254 nm überwacht werden, während die Tz-NHS und Tz-Bn-NOTA werden am besten bei einer Wellenlänge von 525 nm überwacht.
   HINWEIS: Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 0: 100 MeCN / H ₂ O (beide mit 0,1% TFA) bis 100: 0 MeCN / H ₂ O über 25 min und einer Analysen 4,6 x 250 mm _C18-Säule verwendet wird die Retentionszeiten von Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS und NH ₂ -Bn-NOTA wird etwa 15 min, 16,5 min und 10 min, betragen. Das Produkt kann von den anderen Reaktionskomponenten entweder in einem einzigen Durchgang oder mehreren Durchläufen unter Verwendung einer semi-präparativen oder präparative _{C18-HPLC-Säule} ¹ H-NMR, anal, gereinigt werden.ytical HPLC und ESI-MS sind Methoden, die verwendet werden können, um die Reinheit des abgeschlossenen Tz-Bn-NOTA Vorläufer verifizieren. ¹¹
5. Frieren Sie die gesammelten HPLC Eluenten mit flüssigem Stickstoff.
6. Wickeln Sie das gefrorene Sammelröhrchen in undurchsichtigen Aluminiumfolie.
7. Das tiefgefrorene Sammelröhrchen in einer Gefriertrocknung Schiff O / N, um das HPLC mobilen Phase zu entfernen.
8. Lagern Sie das gereinigte Produkt (ein helles rosa Feststoff) im Dunkeln bei -80 ° C.
   Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige Tz-Bn-NOTA Vorstufe für mindestens 1 Jahr unter diesen Bedingungen stabil.

2. Herstellung huA33-TCO Immunkonjugat

1. In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 1 mg / ml (2,7 mM) Lösung von TCO-NHS in trockenem DMF.
2. In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2 mg / ml (13,3 & mgr; M) Lösung von huA33 in 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (0,01 M PO _{4 ^3-,} 0,154 M NaCl).
3. Mit Hilfe von kleinen Aliquoten (<5 & mgr; l) von 0,1 M Na ₂ CO _3, pH-Wert der Antikörperlösung auf 8,8-9,0 einzustellen. Verwenden Sie entweder pH-Papier oder ein pH-Meter mit einer Mikroelektrode, um den pH-Wert zu überwachen und darauf achten, nicht, damit der pH-Wert auf pH-Wert über 9,0 steigen.
4. Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen der TCO-NHS-Lösung entsprechend 8 Moläquivalente des aktivierten Esters. Fügen Sie beispielsweise 7,9 ul der 1 mg / ml TCO-NHS-Lösung (1,07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) an die 1 ml 2 mg / ml huA33 Antikörperlösung (1,33 x 10 ^-8 mol huA33). 5% DMF nicht überschreiten Volumenkonzentration in der Lösung.
5. Vorsichtig mischen Sie die Lösung durch Invertierung der Mikrozentrifugenröhrchen mehrmals.
6. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß in undurchsichtigen Aluminiumfolie.
7. Lassen Sie die Lösung für 1 h bei RT unter leichtem Rühren inkubiert.
8. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur, reinigen das resultierende Immunkonjugat mit einem abgepackten Einweg size Ausschluss Entsalzungssäule. Zuerst spülen Sie die Größenausschlusssäule, wie vom Hersteller beschrieben, welche die über die Spalte vorhanden Konservierungsmittel während der Lagerung zu entfernen. Fügen Sie dann das Reaktionsgemisch auf die Größenausschlusssäule, spülen Sie die Säule mit 1,5 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung, und anschließend das Produkt mit 2 ml 0,9% steriler Kochsalzlösung als Laufmittel zu sammeln.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird das fertige huA33-TCO als 2 ml Lösung zu erhalten.
9. Messung der Konzentration des resultierenden huA33-TCO auf einem UV-Vis-Spektrophotometers.
10. Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren den huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off.
    HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass, während huA33 und eine Vielzahl von anderen bekannten Antikörpern (zB Bevacizumab, Trastuzumab, Cetuximab und J591) sind sehr tolerant gegenüber, die konzentriert, Aggregation und Präzipitation kann nach Konzentration in anderen Fällen auftreten. Forscher versuchen diese procedure mit einem neuen Antikörper sollte die Literatur oder ihrer eigenen Kenntnisse des fraglichen Antikörpers mit Bezug darauf, ob oder nicht, um den Antikörper zu konzentrieren vertrauen.
11. Lagern Sie das ausgefüllte huA33-TCO Immunkonjugat bei 4 ° C im Dunkeln.
    Anmerkung: Dies ist eine akzeptable Anhaltepunkt in dem Verfahren. Die fertige mAb-TCO-Konjugat sollte für mindestens 3 Monate unter diesen Lagerbedingungen stabil sein.

3. ⁶⁴ Cu Radiomarkierung von Tz-Bn-NOTA

Hinweis: dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte - oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität - Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

1. In einem 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten Sie eine 0,5 mg / ml (723 & mgr; M) Lösung von Tz-Bn-NOTA.
2. In einem 1,7 ml MicroCentrifuge Rohr, mit 10 ul des Tz-Bn-NOTA Lösung (5 ug) und 400 ul 0,2 M NH ₄ OAc, pH _5,5-Puffer.
3. Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, Messung und Aufzeichnung der Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator vor und nach den folgenden Schritten in der folgenden Protokoll (3,4-3,8). Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten helfen.
4. In 2000 & mgr; Ci (74 MBq) von ⁶⁴ Cu auf die Tz-Bn-NOTA Lösung.
   HINWEIS: In der Regel wird ^[64 Cu] CuCl ₂ in einem kleinen Volumen (<30 ul) 0,1 N HCl zugeführt wird, und damit nur geringe Mengen (<10 ul) dieser Stammlösung werden für die Radiomarkierungsreaktion benötigt. Wenn größere Mengen des ^[64 Cu] CuCl ₂ Lager benötigt werden, ist der Radiomarkierungsreaktion tolerant Erhöhung der Gesamtreaktionsvolumen. Jedoch sollte der pH-Wert der Radiomarkierungsreaktion Lösung sorgfältig überwacht, um sicherzustellen,dass er nicht unter pH 4,0 fallen.
5. Die Lösung wird für 10 min bei RT unter leichtem Rühren inkubiert.
6. Nach 10 min Inkubation, reinigen Sie das Gerät mit _{Umkehrphasen-C18-HPLC-Chromatographie.} Die Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC-Geräte-Setup jedes Labor (Pumpen, Säulen, Schläuche, etc.). Jedoch, um ein Beispiel zu präsentieren, wenn ein Gradient von 5:95 MeCN / H ₂ O (beide mit 0,1% TFA) bis 95: 5 MeCN / H ₂ O über 15 min verwendet wird, die Rückhaltezeit von ⁶⁴ Cu-TZ Bn-NOTA sollte etwa 9,8 min, während freie, nicht komplexierte Cu ⁶⁴ wird mit der Lösungsmittelfront bei etwa 2-4 min zu eluieren.
7. Mit einem Rotationsverdampfer, entfernen Sie die HPLC Eluenten.
8. Abgeblasen, und der ^64-Cu Tz-Bn-NOTA Produkt in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
   HINWEIS: In Anbetracht der 12,7 hr physikalische Halbwertszeit von ⁶⁴ Cu, ist dies kein akzeptables Anhaltepunkt in dem Verfahren. Führen Sie die Synthese von ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NICHTEin unmittelbar vor der Injektion des Radioliganden, und folgt nach Schritt 3.7 Schritt 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

HINWEIS: Wie in Protocol Abschnitt 3, wird dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Maßnahmen, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

1. In einem weiblichen athymischen nackten Maus, subkutan Implantat 1 x 10 ⁶ SW1222 Kolorektalkrebszellen und ermöglichen, dass diese in einem 100-150 mm ³ Xenograft (9-12 Tage nach der Beimpfung) wachsen. ¹¹
2. Ein Aliquot des huA33-TCO-Lösung von Protocol Abschnitt 2 auf eine Konzentration von 0,5 mg / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
3. Injizieren 200 ul der huA33-TCO-Lösung (100 & mgr; g) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen.
4. Lassen Sie 24 Stunden für die Akkumulation des huA33-TCO im Tumor der Maus.
5. Verdünne die ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand in einer Konzentration von 1,5 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
6. Injizieren 200 ul des ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA Radioligand-Lösung (300 & mgr; Ci; 11,1 MBq; 1,6 nmol von ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA, unter der Annahme einer spezifischen Aktivität von 6,7 MBq / nmol) in die Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen.
7. An der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 2, 6, 12, oder 24 Stunden nach der Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch.
8. Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner. Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und wenden Tier Salbe auf den Augen der Maus, um das Trocknen während der Narkose zu verhindern.
9. Erwerben Sie die PET-Daten für die Maus über einen statischenScannen mit einem Minimum von 20 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters von 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam.

Ergebnisse

Die ersten drei Schritte des Experiments - die Synthese von Tz-Bn-NOTA, die Konjugation von TCO zu huA33 und der radioaktiven Markierung des Tz-Bn-NOTA konstruieren (Abbildungen 3 und 4) - sind sehr zuverlässig. Im Fall der oben beschriebenen Verfahren wurde die Tz-Bn-NOTA Konstrukt in hoher Ausbeute und Reinheit hergestellt. Die huA33 Antikörper wurde mit 4,2 ± 0,6 TCO / mAb modifiziert und Tz-Bn-NOTA wurde radioaktiv markiert und mit ⁶⁴ Cu, um das gereinigte Radioligand ...

Diskussion

Der Hauptvorteil dieser pretargeted PET Strategie ist, dass es in der Lage ist die Abgrenzung von Tumoren mit Ziel-zu-Hintergrund-Bildkontrast bei nur einem Bruchteil der direkt markierten Antikörpern produziert Hintergrund Strahlungsdosis. Zum Beispiel wird in dem hier beschriebenen Darmkrebs Abbildungssystem, Daten von akuten Bioverteilung Experimente wurden verwendet, um die Dosimetrie Berechnungen für die ⁶⁴ Cu-Basis Pretargeting Strategie zusammen mit direkt markiertem ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 und <...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C