Укрощение Bioorthogonal Обратная электронной Demand Дильса-Альдера циклоприсоединения для Pretargeted ПЭТ

Резюме

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Аннотация

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Введение

За последние тридцать лет, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) стала незаменимым клиническим инструментом в диагностике и лечении рака. Антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки позитронно-эмиссионной радиоизотопов к опухолям из-за своей изысканной сродством и специфичностью для биомаркеров рака. ^1,2 Тем не менее, относительно медленные Фармакокинетика в естественных условиях антител обязательное использование радиоизотопов с мульти-день физические периоды полураспада. Это сочетание может дать высокие дозы радиоактивного облучения для нецелевых органов пациентов, что является важным осложнением, что имеет особое клиническое значение, так как radioimmunoconjugates вводят внутривенно и поэтому - в отличие от частичных сканирований тела КТ - результат в поглощенных доз в каждой части тела, независимо от опрошенных тканей.

Для того, чтобы обойти эту проблему, значительные усилия были посвящены развитмат ветствующую защитную эк ПЭТ стратегий изображений, что отделить радиоизотоп и целевой части, таким образом, используя благоприятные свойства антител, одновременно обходя их внутренние ограничения фармакокинетические. Эти стратегии - наиболее часто называют pretargeting или многоступенчатый таргетинг - обычно используют четыре стадии: (1) введение антител, способных связываться как антиген и меченый лиганд; (2) накопление антитела в ткани-мишени и ее выведения из крови; (3) введение радиоактивного небольшой молекулы; и (4) лигирование в естественных радиолиганда с антителом с последующим быстрым выведением избыточных радиолиганда. ^3-8 В некоторых случаях, дополнительной очистки агент вводят между этапами 2 и 3, чтобы ускорить выделение любого антитела что до сих пор, чтобы связать опухоли и остается в крови. ⁵

Вообще говоря, TWО типы pretargeting стратегий являются наиболее распространенными в литературе. В то время как оба оказались успешными в доклинических моделей, они также обладают ключевые ограничения, которые препятствуют их клиническое применение. Первая стратегия опирается на высоким сродством между стрептавидином, конъюгированным антител и биотин-модифицированный радиоактивные метки; Однако иммуногенность стрептавидином-модифицированного антитела, оказалось, беспокойство проблема в связи с переводом. ^5,6,9,10 Вторая стратегия, напротив, использует биспецифических антител, которые были генетически сконструированных для связывания как рак биомаркеров антиген и малая молекула с радиоактивной меткой Гаптен. ^3,11-14 Хотя этот последний маршрут, конечно, творческий, его широкое применение ограничивается сложностью, расходы, и отсутствие модульности системы.

Недавно мы разработали и опубликовали pretargeted методологии ПЭТ на основе спроса обратная электронного Дильса-Альдера (IEDDA) реакции циклоприсоединения между транс -cyclooctene (TCO) и тетразин (TZ;. Рисунок 1) ^{11, а} сама реакция была известна на протяжении десятилетий, IEDDA химия пережила возрождение в последние годы в качестве метода биоконъюгации нажмите химии, как показано на увлекательная работа из групп Ральф Вейследер, Джозеф Фокс, и Питер Конти среди других. ^12-15 IEDDA циклоприсоединение была применена в широком диапазоне параметров, в том числе флуоресценции изображений с пептиды, антитела, и наночастиц, а также ядерные изображений . с обеих radiohalogens и radiometals ^16-26 перевязка высокие урожаи, чистый, быстрый (к _1> 30000 M ^-1 с ^-1), избирательное, а также - в критическом. - bioorthogonal ²⁷ в то время как число типов клик химии - в том числе Cu-катализируемой азида алкин cycloadditions, процедить раскрученной азида алкин cycloadditions и Штаудингер Лигations -. являются bioorthogonal как хорошо, это уникальное сочетание быстрой кинетики реакции и bioorthogonality, что делает IEDDA химию так хорошо подходит для pretargeting приложений в целых организмах ^28,29 Вдоль этих линий, важно отметить, что в недавнем докладе от наших лаборатории не было первым применил IEDDA химию pretargeting: первый доклад pretargeted изображений с IEDDA возник из-за работы Россина, и др, и в нем методологии ОФЭКТ, использующей ¹¹¹ В-меченого тетразин ^30..

Как мы уже говорили выше, pretargeting методология имеет четыре довольно простые шаги (рисунок 2). В протоколе в стороны, pretargeted стратегия для ПЭТ колоректального рака, который использует ^64-Си NOTA-меченого тетразин радиолиганда и ТСО-модифицированный конъюгат антитела huA33 будет описано. Однако, в конечном счете модульность этой методологии является одним из его грешь активы, транс -cyclooctene фрагмента может быть добавлена ​​к любой не интернализации антитела и тетразин может быть присоединен к широкому спектру радиоактивных репортеров.

протокол

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC).

1. Синтез TZ-BN-НОТА

1. В небольшой реакционный сосуд, растворите 7 мг NH ₂ -bn-Примечание (1,25 х 10 ^-2 ммоль) в 600 мкл раствора NaHCO ₃ буфера (0,1 М, рН 8,1). Проверьте рН раствора. Если необходимо, довести рН раствора до 8,1 с помощью небольших аликвот 0,1 М Na ₂ CO _3.
2. Добавить раствор NH ₂ -Bn-NOTA до 0,5 мг TZ-NHS (1,25 × 10 ^-3 ммоль) в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
   Примечание: Tz-NHS либо могут быть взвешивают сухой или добавлены из маточного раствора сухого ДМФ или ДМСО (<50 мкл).
3. Разрешить полученный реакционный раствор ют реагировать в течение 30 мин при комнатной температурес мягким агитации.
4. Через 30 мин, очищают продукт с помощью обращенно-фазовой _С18 ВЭЖХ, чтобы удалить непрореагировавший NH ₂ -bn-NOTA. NH _2, -Bn-NOTA можно контролировать при длине волны 254 нм, в то время как Tz-NHS и Tz-n-NOTA лучше контролировали при длине волны 525 нм.
   Примечание: время удерживания, очевидно, сильно зависит от установки оборудования ВЭЖХ каждого лаборатории (насосы, колонки, трубы и т.д.). Тем не менее, чтобы представить, например, если градиент 0: 100 MeCN / H ₂ O (оба с 0,1% TFA) до 100: 0 MeCN / H ₂ O в течение 25 мин и аналитической 4,6 х 250 мм С ₁₈ колонке используется , время удерживания TZ-BN-Нота, TZ-NHS, и NH ₂ -Bn-NOTA будет около 15 мин, 16,5 мин и 10 мин, соответственно. Продукт может быть очищен от других компонентов реакционных в любом одном периоде или нескольких трасс с использованием полупрепаративной и препаративной С ₁₈ колонку HPLC. ¹ Н-ЯМР, анальныйytical ВЭЖХ и ESI-MS все методы, которые могут быть использованы для проверки чистоты законченного Tz-BN-NOTA предшественника. ¹¹
5. Замораживание собранную ВЭЖХ элюент с помощью жидкого азота.
6. Оберните замороженную пробирку в непрозрачной алюминиевой фольги.
7. Поместите замороженные пробирки в лиофилизации судна O / N, чтобы удалить ВЭЖХ подвижную фазу.
8. Храните очищенный продукт (ярко-розовый твердый) в темноте при -80 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это приемлемо остановочный пункт в процедуре. Завершено Tz-BN-NOTA предшественником является стабильным в течение по крайней мере 1 год в этих условиях.

2. Подготовка huA33-TCO иммуноконъюгат

1. В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 1 мг / мл (2,7 мМ) раствор TCO-NHS в сухом ДМФ.
2. В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 2 мг / мл (13,3 мкмоль) раствор huA33 в 1 мл фосфатно-буферным раствором, рН 7,4 (0,01 М PO _{4 ^3-,} 0,154 М NaCl).
3. Использование небольших аликвот (<5 мкл) 0,1 М Na ₂ CO _3, довести рН раствора антител к 8,8-9,0. Используйте либо индикаторную бумагу или рН-метр с микроэлектродом контролировать рН, и будьте осторожны, чтобы не допустить pH подняться выше рН 9,0.
4. После того, как раствор антитела при правильном рН, добавить объем раствора ТСО-NHS, соответствующей 8 мол рных эквивалентов активированного сложного эфира. Например, добавьте 7,9 мкл 1 мг Раствор / мл TCO-NHS (1,07 х 10 ^-7 моль TCO-NHS) к 1 мл раствора 2 мг / мл huA33 антител (1,33 х 10 ^-8 моль huA33). Не более 5% по объему DMF в растворе.
5. Аккуратно перемешайте раствор, переворачивая пробирку микроцентрифужных несколько раз.
6. Оберните микроцентрифужную трубку в непрозрачной алюминиевой фольги.
7. Разрешить раствор инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре при умеренном перемешивании.
8. После 1 ч при комнатной температуре, в результате очистки иммуноконъюгата с использованием предварительно упакованные одноразовые Sizе исключение колонка для обессоливания. Во-первых, промыть эксклюзивной колонке, как описано поставщика, чтобы удалить какие-либо консерванты присутствует на колонке при хранении. Затем добавляют в реакционную смесь в колонке гель, промыть колонку с 1,5 мл 0,9% стерильного физиологического раствора, а затем собрать продукт, используя 2 мл 0,9% стерильного солевого раствора в качестве элюента.
   Примечание: Этот шаг даст заполненную huA33-совокупную стоимость владения в виде раствора в 2 мл.
9. Измерьте концентрацию полученного в результате huA33-ТШО на УФ-Vis спектрофотометр.
10. Если концентрация выше, желательно, концентрат раствор huA33-TCO с использованием центробежного блок фильтра с молекулярной массой 50000 отсечки.
    Примечание: Важно отметить, что в то время huA33 и множество других известных антител (например, бевацизумаб, трастузумаб, цетуксимаб и J591) очень терпим к концентрированием, агрегация и осаждение может происходить при концентрации и в других случаях. Исследователи, пытающиеся это ProcedЮр с новым антитела должен доверять литературе или их собственных знаний антитела идет речь в отношении того, действительно ли концентрировать антитела.
11. Храните заполненную huA33-TCO иммуноконъюгат при 4 ° С в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приемлемо остановочный пункт в процедуре. Завершения МАБ TCO сопряжены должен быть стабильным в течение по крайней мере 3 месяцев в этих условиях хранения.

3. ⁶⁴ Cu радиоактивной из TZ-BN-НОТА

Примечание: Этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих действий - или при выполнении любых других работ с радиоактивностью - исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

1. В 1,7 мл трубки микроцентрифужных, подготовить 0,5 мг / мл (723 мкм) решение TZ-BN-НОТА.
2. В 1,7 мл MicroCentrifuge трубки, добавляют 10 мкл раствора Tz-n-Примечание (5 мкг), чтобы 400 мкл 0,2 М NH ₄ OAc рН 5,5 _буфер.
3. В интересах надлежащего радиохимического ноте учета, измерения и регистрации количества радиоактивности в образце с помощью дозы калибратор до и после наступления шагов в приведенной ниже протокола (3,4-3,8). Это поможет с точного определения радиохимических урожайности.
4. Добавить 2000 мкКи (74 МБк) от ⁶⁴ Cu в растворе Tz-n-NOTA.
   Примечание: Как правило, ^[64 Cu] CuCl ₂ подается в небольшом объеме (<30 мкл) 0,1 Н HCl, и, таким образом, только небольшие объемы (<10 мкл) этого раствора необходимо для реакции радиоактивной метки. Если крупные объемы ^[64 Cu] CuCl ₂ акции необходимы, реакция радиоактивной терпимо увеличения общего объема реакционной смеси. Тем не менее, значение рН реакционной радиоактивной раствора следует тщательно контролировать, чтобы обеспечитьчто он не упадет ниже рН 4,0.
5. Разрешить раствор инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре при умеренном перемешивании.
6. После 10 мин инкубации, очищают продукт с помощью обращенно-фазовой С ₁₈ ВЭЖХ. Время удерживания, очевидно, сильно зависит от установки оборудования ВЭЖХ каждого лаборатории (насосы, колонки, трубы и т.д.). Тем не менее, чтобы представить, например, если градиент 5:95 MeCN / H ₂ O (оба с 0,1% TFA) до 95: 5 MeCN / H ₂ O в течение 15 мин, используется, время удерживания ⁶⁴ Cu-Tz- Bn-NOTA должна быть около 9,8 мин, а бесплатно, незакомплексованный ⁶⁴ Cu будет элюирования с фронта растворителя составляет около 2-4 мин.
7. С использованием роторного испарителя, удалить ВЭЖХ элюента.
8. Повторного растворения продукта ⁶⁴ Cu-Tz-n-NOTA в 0,9% стерильного солевого раствора.
   Примечание: данное 12,7 ч физический период полураспада ⁶⁴ Cu, это не приемлемо остановочный пункт в процедуре. Выполните синтез ⁶⁴ Cu-TZ-BN-НЕНепосредственно перед инъекцией радиоактивного и следовать шаг за 3,7 сразу за шагом 4,5.

4. В Vivo Pretargeted ПЭТ

Примечание: Как и в разделе 3 протокола, этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих шагов исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

1. В женской бестимусных голых мышей, подкожно имплантата 1 х 10 ⁶ SW1222 колоректального рака клеток и позволить им расти в 100-150 мм ³ ксенотрансплантате (9-12 дней после прививки). ¹¹
2. Развести аликвоту раствора huA33-ППО от протокола разделе 2 до концентрации 0,5 мг / мл в 0,9% стерильного солевого раствора.
3. Вводят 200 мкл раствора huA33-TCO (100 мкг) в хвостовую вену ксенотрансплантата мыши, несущей,
4. Разрешить 24 ч для накопления huA33-ТШО в опухоли мыши.
5. Развести ⁶⁴ Cu-Tz-n-NOTA радиолиганда в концентрации 1,5 мКи / мл в 0,9% стерильного солевого раствора.
6. Вводят 200 мкл ⁶⁴ Cu-Tz-n-NOTA раствора радиолиганда (300 мкКи; 11,1 МБк; 1,6 нмоль ⁶⁴ Cu-TZ-BN-Нота, при условии, удельную активность 6,7 МБк / нмоль) в хвостовую вену ксенотрансплантат мышей, несущих.
7. В момент времени желательно изображений (например, 2, 6, 12 или 24 ч после инъекции), обезболить мышь с 2% изофлуран: газовую смесь кислорода.
8. Наведите на кровати маленькое животное ПЭТ сканера. Поддержание анестезии во время сканирования с использованием 1% в ИФ: газовую смесь кислорода. До размещения животное на планшете сканера, убедитесь, анестезии по методу схождение щепотку и применять ветеринарный мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии.
9. Приобретать данные ПЭТ для мыши с помощью статическогосканирование с минимумом 20000000 совпадающих событий, используя окно энергии 350-700 кэВ и временную окно совпадение 6 нс. После завершения сделки по приобретению изображения, не оставляйте мышь без присмотра и не кладите его в клетку с другими мышами, пока он не пришел в сознание.

Результаты

Начальные три этапа эксперимента - синтез TZ-BN-Нота, сопряжения ТШО huA33, и радиомечения в TZ-BN-НОТА построить (рис 3 и 4) - отличаются высокой надежностью. В случае описанной выше процедуре, конструкция Tz-n-NOTA был синтезирован с высоким выходом и чистотой. HuA33 антитела был изм?...

Обсуждение

Основным преимуществом этого pretargeted стратегии ПЭТ является то, что он способен разграничения опухоли с целевой к фону контрастности изображения на только часть фонового излучения дозы производится непосредственно меченых антител. Например, в колоректального рака системы формирован?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C