JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Abstract

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Introduction

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمعاهد القومية للصحة المبادئ التوجيهية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ألاباما في برمنغهام استخدام الحيواني.

1. الحصول على الحمض النووي الريبي والحمض النووي المخصب من نجمي السكان الذين يستخدمون نيون المنشط خلية الفرز (FACS) من الخلايا النجمية من كامل أنسجة المخ

  1. الحيوان رزين مع CO 2 لمدة 1 دقيقة ثم قطع رأس بسرعة. تشريح القشور كما هو موضح في البوكيرك وآخرون، 26؛ ليس من الضروري لإزالة السحايا.
    ملاحظة: تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحت S100β (علامة نجمية) المروج التي كتبها إيتاكورا وآخرون 27 وتستخدم لFACS فرز الخلايا النجمية.
  2. إعداد جناسة الدماغ كله باستخدام عدة التفكك غراء في ظل ظروف غير معقمة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. للحرارة تفعيل غراء عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة. ملاحظة:وتقدم الحل غراء من قبل الشركة المصنعة ويحتوي L-السيستين وEDTA (انظر الجدول المواد).
    1. قطع أو DREMEL ثقب في الجزء العلوي من أنبوب 50 مل مخروطي الشكل للسماح أنابيب تحمل 95٪ O 2: CO 2 5٪ ليكون الطعام في أنبوب مخروطي مغلق (الشكل 1A). وضع القشور تشريح في طبق ثقافة 10MM تحتوي على وسائل الاعلام تفارق (MEM تستكمل مع الجلوكوز 20MM والبنسلين / الستربتومايسين (500 U / مل)، ومعايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2)، واستخدام شفرة حلاقة نظيفة لتخطر على الأنسجة في 1 × 1 مم 2 قطعة.
  3. نقل الأنسجة باستخدام 10 مل pipetman اليدوي إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي الحل غراء. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع نقل ماصة قبل التفريغ لتقليل كمية من وسائل الاعلام تفارق ترحيلها. إبقاء الحل غراء معايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2 عن طريق تبادل الغازات السطح لمدة الحضانة. لا فقاعة غراء solutiعلى. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  4. وبعد الحضانة في حل غراء، الأنسجة يسحن 10 مرات مع ماصة 10 مل نقل بسرعة بطيئة. الطرد المركزي تعليق خلية غائم في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    1. تتوازن الدناز / الزلال حل المانع (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) عن طريق تبادل الغازات السطحية واعادة تعليق الخلايا مكعبات في 3 مل من محلول الدناز / الزلال المانع. إعداد التجاري التدرج الكثافة متقطعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. تدور متقطع التدرج الكثافة في 1000 x ج لمدة 6 دقائق. عزل الخلايا فصلها من أسفل أنبوب عن طريق مص بيليه السفلي باستخدام ماصة.
  6. اعادة تعليق الخلايا فصلها في 2-3 مل من DPBS مع 0.02٪ ألبومين المصل البقري و 1 ملغ / مل الدناز أو HEPES فضل مخزنة سائل الإعلام والثقافة. تمر عبر 40 ميكرون تصفية قبل FACS (الشكل 2A). تبقي الخلايا على الجليد حتى الفرز.
    1. أداء FACS 28.
    2. خلايا بيليه في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الخلايا النجمية مكور يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.
  7. استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام طريقة عزل المفضلة 29 30. تقييم RNA وتركيز الحمض النووي والجودة عبر الطيف وbioanalyzer 31.
    ملاحظة: الاستفادة فقط RNA ذات جودة عالية وDNA في الخطوات اللاحقة، 260/280 = 2،0-2،2 و1،8-1،9، على التوالي. تحليل Bioanalyzer ضروري لتقييم لتدهور RNA أو DNA تجزئة. RNA أو DNA يمكن أن تستخدم مباشرة أو تخزينها في -80 ° C أو -20 درجة مئوية، على التوالي لدراسات لاحقة.

2. تقييم الحامض النووي الحالة من الجينات باستخدام مثلأيشن تراعي عالية الدقة التحليل تذوب (MS-HRMA)

  1. أدخل تسلسل الجينات في المصالح في فضل برنامج رسم الخرائط مثيلة على الانترنت لتحديد أي الجزر الدليل السياسي الشامل في الجيناتالفائدة 32.
    1. الاشعال تصميم ضد بيسلفيت تحويلها تسلسل DNA 33 و تضخيم باستخدام البلمرة DNA المفضل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تحقق تضخيم حجم المنتج عن طريق تشغيل 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة. متجر الاشعال في تركيز الأسهم من 20 ميكرومتر في -20 ° C.
  2. بيسلفيت تحويل 500-1،000 نانوغرام من الحمض النووي من كل عينة DNA والميثيلي والمعايير تتراوح بين 0-100٪ من الأنواع الحيوانية نفسها 34. عينات أزل لتوفير تركيز 20 نانوغرام / ميكرولتر. تحقق من تركيز الحمض النووي تحويل بيسلفيت عبر طيفي 31.
  3. إعداد 20 ميكرولتر ردود الفعل لتضخيم MS-HRM باستخدام البلمرة DNA المفضل والاشعال في 5 ميكرومتر تركيز وفقا للجدول 1 و 2. تشغيل جميع العينات، بما في ذلك المعايير DNA ومميثل FACS، في ثلاث نسخ.
  4. اعتمادا على برامج التحليل، تعيين قبل وبعد بدء ووقف المعلماتحول التحولات في منحنى ذوبان. مجموعة قبل ذوبان بداية والمعلمات توقف قبل تذوب حتى الفرق بين الاثنين هو 0،2-0،5 درجة مئوية. بدء تعيين ما بعد ذوبان وبعد ذوبان وقف بالمثل. استخراج البيانات الفرق في درجة الحرارة الذروة لكل عينة.
  5. باستخدام المعايير في المئة مميثل (ص القيمة) والذي يقابل متوسط ​​الاختلافات في درجة الحرارة ذروتها (خ القيمة) توليد معادلة الانحدار الخطي (الشكل 3A-B، الجدول 3-4). استخدام هذا معادلة الانحدار الخطي لتقدير حالة مثيلة من العينات المجهولة 35.

3. تقييم فرط ميثليته-آخر المروج عبر استخدام luciferase الفحص

  1. تحديد الجزر الدليل السياسي الشامل من الجين المستهدف (الخطوة 2.1). PCR تضخيم المناطق ذات الاهتمام 36 و استنساخ المنبع من luc2 اليراع مراسل luciferase المراسل الجينات لإنتاج البلازميدات الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 37.
  2. خطي 30 ميكروغرام من البلازميد الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 عبر تقييدانزيم الهضم 38. التحقق من مواقع لتقييد هضم وتجنب تخفيضات مزدوجة باستخدام برنامج القاطع المفضل 38. للحرارة وقف نشاط الإنزيمات في درجة الحرارة ومدة المناسبة التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من الحمض النووي يحدث خلال خطوة الخطية.
  3. ميثيل البلازميدات خطي باستخدام الدليل السياسي الشامل methylase (M.Sssl) O / N عند 30 درجة مئوية أو ترك دون علاج بروتوكول المصنعة التالية باستثناء التعديلات التالية.
  4. أداء 50 ميكرولتر ردود الفعل.
  5. استخدام 5 وحدات من الدليل السياسي الشامل methylase إلى ميثيل 700 نانوغرام من البلازميد خطي.
  6. تشغيل ردود الفعل O / N ل13-19 ساعة.
  7. وبعد رد فعل methylase الدليل السياسي الشامل، نفذ تنظيف DNA باستخدام معيار، المتاحة تجاريا غشاء السيليكا جل تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد الدليل السياسي الشامل methylase رد فعل، وفقدان 30-60٪.
  8. تحقق مثيلة من البلازميدات عن طريق تقييد هبان II هضم.
  9. تأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي ميثليته أو غير ميثليته وتقييد هضم مع هبان II لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام 5-10 وحدات من هبان II لكل DNA ميكروغرام. بعد هبان II الهضم، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. تشغيل كل من الدليل السياسي الشامل البلازميدات مميثل وغير مثيلة على 1٪ هلام DNA الاغاروز في TAE أو TBE العازلة عند 100 V لمدة 45 دقيقة لتصور (الشكل 4B).
  10. البلازميدات تخضع كل من مميثل وغير ميثليته الهضم مزدوجة مع الانزيمات تقييد المناسبة لإطلاق سراح كامل طول لوك 2 (ناقلات) وجزيرة الدليل السياسي الشامل (إدراج) شظايا 38. أداء مزدوج الهضم O / N في درجة حرارة مناسبة والإنزيمات للحرارة تعطيل التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من تركيز الحمض النووي يحدث خلال تقييد مزدوج هضم.
  11. تشغيل البلازميدات يهضم ضعف في 1٪ agarose هلام DNA في 100 V لمدة 1 ساعة للسماح للانفصال سو ناقلات وإدراج (الشكل 4C). الحذر. ارتداء الأشعة فوق البنفسجية واقية درع الوجه، ووضع جل DNA على ضوء أسود الطاولة لتصور العصابات. على أساس الحجم والمكوس إدراج الميثيلي وغير ميثليته وناقلات غير ميثليته باستخدام شفرة جراحية نظيفة.
  12. هلام استخراج الحمض النووي باستخدام الفينول المشبعة، ودرجة الحموضة 6.6. لفترة وجيزة، تزن هلام DNA التي تحتوي على ناقل أو إدراج. استخدام 100 ميكرولتر من الفينول في 0.1 غرام من هلام DNA. التجانس هلام DNA في الفينول استخدام الزجاج dounce الخالط.
  13. إضافة الكلوروفورم (باستخدام 1/5 من حجم الفينول) ويهز عينات لمدة 20 ثانية. احتضان العينات في RT لمدة 2-3 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة (16.1 X 1000 x ج) في 4 درجات مئوية.
  14. إزالة محلول مائي وإضافة حجم 0.1X من 3 M خلات الصوديوم وحجم 2.5X من الايثانول. احتضان العينات لمدة 1 ساعة على -80 ° C. بعد الحضانة، وإزالة الإيثانول وإعادة تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من العازلة المفضل. خسارة كبيرة من الحمض النووي يحدث العزلة التالية من إدراج وناقلات، 30-50٪ لوق ق.
  15. إعادة ligate إدراج مميثل وغير مثيلة لغير ميثليته المتجه باستخدام T4 DNA يغاز 38. استخدام نسبة 1: 4 ناقلات لادخال لردود الفعل ربط. رد فعل الإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الحجم الكلي لل50 ميكرولتر لردود الفعل واحتضان O / N عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو على الجليد مع غطاء على دلو الجليد.
  16. بعد ربط، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد رد فعل ربط، وهي تقريبية فقدان 30-50٪ من الحمض النووي. التحقق من إعادة ربط كل من يعمل على 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة وتقييم تركيز-ligated إعادة البلازميدات (الشكل 4D).
  17. Transfect البلازميدات ميثليته أو غير مثيلة في الخلايا D54 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. الخلايا D54 البذور على 12 لوحة جيدا في 0.14 × 10 6 خلايا / جيد.
  18. وبعد 24 ساعة، وخلايا transfect وايتركيزات متساوية عشر إما (1) البلازميد غير methyated الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل أو (2) ميثليته البلازميد الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل.
  19. تسمح للخلايا ل transfect لمدة 24 ساعة قبل إجراء المزدوج luciferase الفحص. أداء الاختبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أداء قراءات باستخدام luminometer. قراءة كل بئر في ثلاث نسخ.
  20. حساب نسبة اليراع luciferase النشاط إلى Renilla أو غيرها من الأنشطة السيطرة luciferase المراسل. تطبيع الميثيلي واليراع: السيطرة luciferase النشاط إلى اليراع غير ميثليته: السيطرة luciferase النشاط بتقسيم luciferase النشاط الميثيلي التي كتبها luciferase النشاط غير ميثليته

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد اكتسب السكان المخصب من الخلايا النجمية عبر FACS الفرز من EGFP-S100β الحيوانات المعدلة وراثيا 27. بسبب تدني نوعية الخلايا والجزيئات الجزيئية المعزولة من الحيوانات القديمة من بعد الولادة اليوم 50 (P50)، والحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين P0-P40 هي الأمثل لمثل هذه التجا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have no disclosures.

Acknowledgements

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

References

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103 MS HRMA luciferase FACS Kir4 1 KCNJ10

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved