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  • Riepilogo
  • Abstract
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  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Abstract

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Introduzione

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

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Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute. La cura e l'uso Comitato degli animali presso l'Università di Alabama a Birmingham ha approvato l'uso degli animali.

1. Ottenere RNA e DNA da un Arricchita astrocitica Popolazione utilizzando fluorescenti Cellulari Attivato Ordinamento (FACS) di astrociti da tutto il tessuto del cervello

  1. Animale sedate con CO 2 per 1 minuto e poi rapidamente decapitarlo. Sezionare cortecce come descritto in Albuquerque et al, 26.; non è necessario rimuovere meningi.
    Nota: i ratti transgenici che esprimono eGFP sotto il S100β (un marcatore astrociti) promotore sono stati generati da Itakura et al 27 e utilizzati per FACS ordinamento degli astrociti..
  2. Preparare tutto omogenato cerebrale utilizzando un kit di dissociazione papaina in condizioni non sterili, secondo il protocollo del produttore. Calore disattivare papaina a 37 ° C a bagnomaria per 10 min. Nota:Soluzione papaina è fornito dal costruttore e contiene L-cisteina e EDTA (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Tagliare o dremel un foro nella parte superiore di un tubo da 50 ml per permettere tubazione che trasporta il 95% O 2: 5% CO 2 da alimentare in una provetta conica chiusa (Figura 1A). Mettere cortecce sezionato in 10 millimetri piatto di coltura contenenti supporti dissociazione (MEM supplementato con 20 mM glucosio e la penicillina / streptomicina (500 U / ml) ed equilibrato al 95% O 2: 5% di CO 2) e utilizzare una lama di rasoio pulito per tritare il tessuto in 1 x 1 mm 2 pezzi.
  3. Tessuto Trasferimento con 10 ml Pipetman manuale a tubo da 50 ml contenente soluzione papaina. Lasciare tessuto di depositarsi fondo pipetta prima dello scarico per minimizzare la quantità di materiale di dissociazione riportati. Mantenere soluzione papaina equilibrati a 95% O 2: 5% CO 2 attraverso lo scambio di gas di superficie per la durata dell'incubazione. Non bolla papaina solution. Incubare il tessuto per 20 minuti a 37 ° C bagnomaria.
  4. Dopo l'incubazione in soluzione papaina, tessuto triturare 10 volte con una pipetta 10 ml di trasferimento a bassa velocità. Centrifugare sospensione cellulare nuvoloso a 1.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    1. Equilibrare soluzione inibitore DNasi / albumina (fornito dal costruttore) attraverso lo scambio di gas superficiale e risospendere le cellule in pellet in 3 ml di soluzione inibitore / DNasi di albumina. Preparare commerciale gradiente di densità discontinuo seguendo le istruzioni del produttore.
  5. Spin gradiente di densità discontinuo a 1.000 xg per 6 min. Isolare le cellule dissociate dal fondo della provetta da succhiare pellet fondo con una pipetta.
  6. Risospendere le cellule dissociate in 2-3 ml di DPBS con 0,02% di albumina di siero bovino e 1 mg / ml DNasi o HEPES buffered preferiti coltura. Passare attraverso 40 micron filtro prima FACS (Figura 2A). Mantenere le cellule in ghiaccio fino a quando l'ordinamento.
    1. Eseguire FACS 28.
    2. Cellule pellet in 1,5 ml provette a 2000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      Nota: astrociti Il pellet possono essere utilizzati immediatamente o conservati in -80 ° C fino al momento dell'estrazione del DNA.
  7. Estratto RNA e DNA utilizzando il metodo preferito di isolamento 29 30. Valutare RNA e concentrazione del DNA e la qualità con spettrofotometro e bioanalizzatore 31.
    Nota: Utilizzare solo RNA alta qualità e il DNA in fasi successive, 260/280 = 2,0-2,2 e 1,8-1,9, rispettivamente. Analisi Bioanalyzer è essenziale per valutare la degradazione dell'RNA o frammentazione del DNA. RNA o DNA possono essere utilizzati immediatamente o conservate in -80 ° C o -20 ° C, rispettivamente per gli studi successivi.

2. Valutare metilazione del DNA Stato di un gene mediante metilazione-sensibile ad alta risoluzione Melt Analysis (MS-HRMA)

  1. Inserisci sequenza del gene di interesse in preferito software di mappatura metilazione online per individuare eventuali isole CpG del genedi interessi 32.
    1. Primer design contro bisolfito convertiti sequenza di DNA 33 e amplificano con DNA polimerasi preferita secondo il protocollo del produttore. Verificare le dimensioni del prodotto amplificato mediante l'esecuzione di un gel di DNA agarosio 1% a 100 V per 45 minuti. Conservare primer a concentrazione magazzino di 20 micron di -20 ° C.
  2. Bisolfito convertire 500-1000 ng di DNA di ciascun campione e DNA metilato standard che vanno da 0-100% delle stesse specie animali 34. Campioni eluire per fornire una concentrazione di 20 ng / ml. Verificare la concentrazione di bisolfito di DNA convertito con spettrofotometro 31.
  3. Setup 20 reazioni microlitri per l'amplificazione di MS-HRM utilizzando DNA polimerasi preferito e primer a 5 micron di concentrazione in base alla tabella 1 e 2. Eseguire tutti i campioni, tra cui DNA e metilato standard FACS, in triplice copia.
  4. A seconda del software di analisi, impostare pre- e post-avviare e arrestare i parametriintorno alle transizioni della curva di fusione. Set inizio pre-fusione e parametri di stop pre-melt così la differenza tra i due è 0,2-0,5 ° C. Imposta l'inizio post-fusione e post-fusione fermare in modo simile. Estrarre i dati differenza di temperatura di picco per ogni campione.
  5. Utilizzando gli standard per cento metilati (y-valore) e le loro corrispondenti differenze di temperatura di picco medi (x valore) genera una equazione di regressione lineare (Figura 3A-B, Tabella 3-4). Utilizzare questa equazione di regressione lineare per stimare lo stato di metilazione di 35 campioni sconosciuti.

3. Valutare Hyper-metilato Promotore Attività via Uso di luciferasi Assay

  1. Identificare isole CpG del gene bersaglio (punto 2.1). PCR amplifica regioni di interesse 36 e clone monte della luc2 Firefly gene della luciferasi giornalista per la produzione di plasmidi CpG-isola-luc2 37.
  2. Linearizzare 30 microgrammi di plasmide CpG-isola-luc2 via restrizionedigestione enzimatica 38. Verificare i siti di restrizione digest e di evitare doppi tagli utilizzando il software di taglio preferito 38. Calore-inattivare enzimi a temperatura e durata adeguata seguenti digestione secondo il protocollo del produttore. Perdita minima di DNA si verifica durante la fase di linearizzazione.
  3. Metilato plasmidi linearizzati con CpG metilasi (M.Sssl) O / N a 30 ° C o lasciare non trattati protocollo seguente produttore tranne che per le seguenti regolazioni.
  4. Eseguire 50 reazioni microlitri.
  5. Utilizzare 5 unità di CpG metilasi per metilare 700 ng di plasmide linearizzato.
  6. Eseguire reazioni O / N per 13-19 ore.
  7. A seguito di CpG reazione metilasi, eseguire la pulitura del DNA utilizzando lo standard, disponibile in commercio membrana di gel di silice pulizia Kit secondo il protocollo del produttore. Perdite significative di DNA si verificano a seguito CpG reazione metilasi, perdita 30-60%.
  8. Verificare metilazione di plasmidi tramite una restrizione Hpa II digest.
  9. Prendere 1 mg di DNA metilato o non metilato e restrizione digerire con Hpa II per 1 ora a 37 ° C. Utilizzare 5-10 unità di Hpa II per ogni mg di DNA. A seguito di Hpa II digestione, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Eseguire entrambi plasmidi metilati e non metilati CpG su un gel di agarosio 1% DNA in tampone TAE o TBE a 100 V per 45 minuti per la visualizzazione (Figura 4B).
  10. Oggetto sia denaturato e non metilato plasmidi a doppia digestione con opportuni enzimi di restrizione per rilasciare full-length luc 2 (vettoriale) e l'isola CpG (inserto) frammenti 38. Eseguire doppio digestione O / N a temperatura adeguata e gli enzimi calore inattivare seguente digestione secondo il protocollo del produttore. Minima perdita di concentrazione di DNA avviene durante doppia restrizione digest.
  11. Eseguire plasmidi doppio digeriti su 1% gel di agarosio DNA a 100 V per 1 ora per permettere la separazione of vettore e inserire (Figura 4C). Attenzione. Indossando UV scudo protettivo faccia, mettere il gel del DNA su un tavolo nero luce di visualizzare bande. In base alle dimensioni, accise inserto metilato e non metilato e non metilato vettore con una lama chirurgica pulito.
  12. Gel estratto di DNA con fenolo saturo, pH 6,6. In breve, pesare gel DNA contenente vettoriale o inserto. Utilizzare 100 ml di fenolo per 0,1 grammi di gel DNA. Omogeneizzare gel DNA fenolo utilizzando Dounce vetro omogeneizzatore.
  13. Aggiungere cloroformio (con 1/5 del volume di fenolo) ed agitare i campioni per 20 sec. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare per 15 minuti a velocità massima (16,1 x 1.000 xg) a 4 ° C.
  14. Rimuovere la soluzione acquosa e 0,1 X. aggiungere volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volte il volume di etanolo. Incubare i campioni per 1 ora a -80 ° C. Dopo l'incubazione, rimuovere l'etanolo e risospendere il DNA in 30 microlitri di tampone preferito. Significativa perdita di DNA avviene seguenti isolamento di inserti e vettori, 30-50% loss.
  15. Re-legare inserti metilato e non metilato al vettore non metilato utilizzando T4 DNA ligasi 38. Utilizzare un rapporto 1: 4 di vettore da inserire per le reazioni legatura. Reazione di installazione in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare un volume totale di 50 microlitri per le reazioni e incubare O / N a -20 ° C o su ghiaccio con coperchio sopra secchiello del ghiaccio.
  16. A seguito di legatura, eseguire la pulitura DNA usando preferita, membrana disponibile in commercio gel di silice ripulire kit. Significativa perdita di DNA si verificano a seguito di reazione legatura, un approssimativo perdita 30-50% del DNA. Verificare ri-legatura eseguendo il 1% gel di DNA agarosio a 100 V per 45 minuti e valutare la concentrazione di plasmidi ri-legatura (Figura 4D).
  17. Trasfettare plasmidi denaturato o non denaturato nelle cellule D54 con un reagente di trasfezione commerciale secondo il protocollo del produttore. Cellule D54 Seed sulla piastra 12 pozzetti alla 0,14 x 10 6 cellule / pozzetto.
  18. A seguito di 24 ore, le cellule trasfettare with concentrazioni uguali di entrambi (1) plasmide non methyated CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale o (2) metilata plasmide CpG luc2 + Renilla o un altro controllo luciferasi vettoriale.
  19. Consentono alle cellule per trasfettare per 24 ore prima di eseguire doppio test luciferasi. Eseguire test secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le letture usando un luminometro. Leggere ogni bene in triplice copia.
  20. Calcolare il rapporto di attività luciferasi Firefly a Renilla o altre attività di controllo della luciferasi. Normalizzare metilato Firefly: attività luciferasi di controllo per non metilato Firefly: attività luciferasi controllo dividendo l'attività luciferasi metilato per attività luciferasi non denaturato

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Risultati

Una popolazione arricchita di astrociti è stato acquisito tramite FACS ordinamento di eGFP-S100β animali transgenici 27. A causa della diminuzione della qualità delle cellule e molecole molecolari isolati da animali di età superiore a postnatale giorno 50 (p50), animali di età p0-P40 sono ottimali per tali esperimenti. Tessuto corticale è stato utilizzato per questi esperimenti. Cortecce da due a sei animali sono stati riuniti insieme. FACS è stata eseguita presso lo stabilimento UAB Comprehensive Cito...

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Discussione

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

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Divulgazioni

The authors have no disclosures.

Riconoscimenti

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

Riferimenti

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