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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Zusammenfassung

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Einleitung

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

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Protokoll

Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Richtlinien behandelt. Die Animal Care und Verwenden Committee an der Universität von Alabama in Birmingham genehmigte Tierversuche.

1. Erhalten RNA und DNA aus einer Enriched Astrozytäre Bevölkerung mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) von Astrozyten aus Whole Brain Tissue

  1. Sedate Tier mit CO 2 für 1 Minute und dann schnell zu enthaupten. Sezieren Kortex wie in Albuquerque et al,. 26; es ist nicht notwendig, Meningen entfernen.
    Hinweis:. Transgenen Ratten exprimieren eGFP unter der S100β (eine Astrozyten Marker) Promotors wurden durch Itakura et al 27 erzeugt und für die FACS-Sortierung von Astrozyten verwendet.
  2. Vorbereitung ganze Gehirnhomogenisat mit einer Papain-Kit Dissoziation unter nicht-sterilen Bedingungen nach dem Protokoll des Herstellers. Wärme aktivieren Papain bei 37 ° C in einem Wasserbad für 10 min. Hinweis:Papain-Lösung wird durch den Hersteller zur Verfügung gestellt und enthält L-Cystein und EDTA (Siehe Tabelle der Materialien).
    1. Geschnitten oder Dremel ein Loch in der Spitze einer 50 ml konischen Röhrchen Rohrtrag 95% O 2 zu ermöglichen: 5% CO 2 in einem geschlossenen konischen Röhrchen zugeführt werden (1A). Platzieren seziert cortices in 10 mm Kulturschale enthaltend Dissoziation Medium (MEM mit 20 mM Glucose und Penicillin / Streptomycin (500 U / ml) ergänzt und 95% O äquilibriert 2: 5% CO 2) und mit einem sauberen Rasierklinge Gewebe in 1 Hackfleisch x 1 mm 2 Stück.
  3. Mit 10 ml Hand Pipetman zu 50 ml konische Röhrchen mit Papainlösung Transfergewebe. Erlauben Gewebe zur Unterseite der Transferpipette vor dem Entladen, um die Menge der Dissoziation Medien übertragenen minimieren begleichen. Halten Papainlösung zu 95% O 2 äquilibriert: 5% CO 2 über die Oberfläche der Gasaustausch für die Dauer der Inkubation. Nicht Blase Papain solutiam. Inkubieren Gewebe für 20 Minuten in 37 ° C Wasserbad.
  4. Nach der Inkubation in Papainlösung, triturate Gewebe 10mal mit 10 ml Transferpipette mit langsamer Geschwindigkeit. Zentrifuge trübe Zellsuspension bei 1.000 g für 5 min bei RT.
    1. Äquilibrieren DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung (Herstellerangabe) über Oberflächengasaustausch und resuspendieren pelletierten Zellen in 3 ml DNase / Albumin-Inhibitor-Lösung. Bereiten kommerziellen diskontinuierlichen Dichtegradienten gemäß Herstellerangabe.
  5. Spin diskontinuierlichen Dichtegradienten bei 1.000 × g für 6 min. Isolieren dissoziierten Zellen vom Boden des Röhrchens durch Ansaugen unteren Pellet mit einer Pipette.
  6. Resuspendieren dissoziierten Zellen in 2-3 ml DPBS mit 0,02% Rinderserumalbumin und 1 mg / ml DNase oder bevorzugte HEPES gepufferte Kulturmedien. Fahren Sie durch 40 & mgr; m-Filter vor der FACS (2A). Halten Sie Zellen auf Eis, bis die Sortierung.
    1. Führen FACS 28.
    2. Pellet-Zellen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen bei 2.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
      Anmerkung: Pelletierte Astrozyten kann sofort verwendet oder in -80 ° C bis die DNA-Extraktion zu halten.
  7. Auszug RNA und DNA mit Hilfe bevorzugte Isolierungsverfahren 29 30. Beurteilen Sie RNA- und DNA-Konzentration und Qualität über Spektralphotometer und Bioanalyzer 31.
    Hinweis: Nutzen Sie nur qualitativ hochwertige RNA und DNA in den nachfolgenden Schritten, 260/280 = 2,0 bis 2,2 und 1,8 bis 1,9 auf. Bioanalyzer Analyse ist wichtig, für die RNA-Abbau oder DNA-Fragmentierung zu bewerten. RNA oder DNA kann sofort verwendet oder in -80 ° C oder -20 ° C, jeweils für die nachfolgenden Untersuchungen gespeichert werden.

2. Bewertung der DNA-Methylierungsstatus eines Gens mit methylierungssensitiven Hohe Auflösung Schmelzanalyse (MS-HRMA)

  1. Geben Sie Gen-Sequenz von Interesse in bevorzugten Online-Methylierungs-Mapping-Software, um alle CpG-Inseln im Gen zu identifizierenInteressen 32.
    1. Design-Primer gegen Bisulfit-konvertierter DNA-Sequenz 33 und verstärken mit bevorzugten DNA-Polymerase nach Herstellerprotokoll. Stellen Sie sicher, verstärkte Produktgröße, indem Sie einen 1% -igen DNA-Gel bei 100 V für 45 min. Shop Primer bei Stammkonzentration von 20 um -20 ° C.
  2. Bisulfit konvertieren 500-1000 ng DNA von jeder Probe und methylierten DNA-Standards im Bereich von 0-100% von der gleichen Tierart 34. Eluieren Proben auf eine Konzentration von 20 ng / & mgr; l bereitzustellen. Stellen Sie sicher, Konzentration von Bisulfit-konvertierter DNA mittels Spektralphotometer 31.
  3. Setup 20 & mgr; l-Reaktionen für MS-HRM-Amplifikation unter Verwendung bevorzugte DNA-Polymerase und Primern bei 5 & mgr; M-Konzentration gemäß Tabelle 1 und 2. Führen Sie alle Proben, einschließlich FACS DNA methylierte und Standards, in dreifacher Ausfertigung.
  4. Je nach Analysesoftware, setzen vor und nach dem Start und Stopp-Parameterum die Übergänge der Schmelzkurve. Set vor, eine Schmelz Start und Pre-Schmelzstoppparameter so dass der Unterschied zwischen den beiden ist von 0,2 bis 0,5 ° C. Stellen Sie nach dem Schmelzbeginn und nach der Schmelze zu stoppen ähnlich. Extrahieren Spitzentemperatur Differenzdaten für jede Probe.
  5. Verwenden Prozent methylierte Standards (y-Wert) und die entsprechenden durchschnittlichen Spitzentemperaturunterschiede (x-Wert) erzeugen einen linearen Regressionsgleichung (3A-B, Tabelle 3-4). Verwenden Sie dieses linearen Regressionsgleichung zur Methylierungsstatus von unbekannten Proben 35 zu schätzen.

3. Bewertung Hyper-methyliert Promotoraktivität durch Verwendung von Luciferase Assay

  1. Identifizieren CpG-Inseln des Zielgens (Schritt 2.1). PCR zu amplifizieren interessierenden Bereiche 36 und Klon stromaufwärts des luc2 Firefly Luziferase-Reportergens an CpG-Insel-luc2 Plasmide 37 zu produzieren.
  2. Linearisieren 30 & mgr; g CpG-Insel-luc2 Plasmid über RestriktionsEnzymverdau 38. Stellen Sie sicher, Standorte für Restriktionsverdau und vermeiden Doppel Schnitte mit bevorzugten Schneidesoftware 38. Wärme inaktivieren Enzyme bei geeigneter Temperatur und Dauer, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalen Verlust an DNA erfolgt während der Linearisierungsschritt.
  3. Methylat linearisierte Plasmide mit CpG-Methylase (M.Sssl) O / N bei 30 ° C oder lassen Sie unbehandelten folgenden Herstellerprotokoll mit Ausnahme der folgenden Einstellungen.
  4. Führen Sie 50 ul-Reaktionen.
  5. Verwenden Sie 5 Einheiten CpG Methylase bis 700 ng linearisierte Plasmid methylieren.
  6. Führen Reaktionen O / N für 13-19 Std.
  7. Nach CpG Methylase-Reaktion, führen DNA-Bereinigung mit handelsüblichen Silicagel-Membran reinigen Kit gemäß Herstellerprotokoll. Erhebliche Verluste der DNA auftreten folgenden CpG Methylase-Reaktion, 30-60% Verlust.
  8. Stellen Sie sicher, Methylierung von Plasmiden über einen HpaII Restriktionsverdau.
  9. Nehmen 1 ug methylierten oder unmethylierten DNA und Restriktionsverdau mit Hpa II für 1 h bei 37 ° C. Verwenden Sie 5-10 Einheiten HpaII pro ug DNA. Nach HpaII Verdauung, führen DNA-Bereinigung mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Laufen die beiden CpG-methylierter und nicht-methylierter Plasmide auf einem 1% Agarose-Gel in TAE-DNA oder TBE-Puffer bei 100 V für 45 min zur Visualisierung (4B).
  10. Gegenstand sowohl methylierten und nicht-methylierten Plasmiden doppelten Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen, um Volllängen-luc 2 (Vektor) und CpG-Insel (insert) -Fragmente 38 freizugeben. Zuführen doppelten Verdau O / N bei geeigneten Temperatur- und Wärme Enzyme zu deaktivieren, die nach Aufschluss nach dem Protokoll des Herstellers. Minimalem Verlust an DNA-Konzentration tritt bei Doppel Restriktionsverdau.
  11. Laufen Doppel verdauten Plasmide auf 1% DNA Agarosegel bei 100 V für 1 Stunde, um die Trennung zu ermöglichen of Vektor und Insert (4C). Vorsicht. Das Tragen von Schutz UV-Gesichtsschutz, legen DNA-Gel auf einer Tischplatte Schwarzlicht, um Bands zu visualisieren. Basierend auf Größe, Verbrauch methylierter und nicht-methylierter Einsatz und nicht-methylierte Vektor mit einem sauberen Skalpell.
  12. Gel-Extrakt DNA mit gesättigtem Phenol, pH-Wert 6,6. Kurz gesagt, wiegen DNA Gel-enthaltenden Vektor oder Einsatz. Verwenden Sie 100 ul Phenol pro 0,1 g DNA-Gel. Homogenisieren DNA-Gel in Phenol unter Verwendung von Glas Dounce-Homogenisator.
  13. In Chloroform (mit 1/5 der Phenolvolumen) und schütteln Proben für 20 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 2-3 min. Zentrifuge für 15 min bei Maximalgeschwindigkeit (16,1 x 1.000 x g) bei 4 ° C.
  14. Entfernen wässrigen Lösung und füge 0,1 X Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 X Volumen Ethanol. Proben Inkubation für 1 h bei -80 ° C. Nach der Inkubation Ethanol entfernen und erneut zu suspendieren DNA in 30 ul bevorzugte Puffer. Signifikanten Verlust der DNA erfolgt nach der Isolierung von Einsätzen und Vektoren, 30-50% loss.
  15. Wieder Ligat methylierter und nicht-methylierter Einsätze nicht methylierte Vektor unter Verwendung von T4-DNA-Ligase 38. Verwenden Sie eine 1: 4-Verhältnis von Vektor für Ligationsreaktionen einfügen. Setup-Reaktion nach Herstellerangaben. Verwenden Sie ein Gesamtvolumen von 50 & mgr; l für Reaktionen und Inkubation O / N bei -20 ° C oder auf Eis mit Deckel auf Eis Eimer.
  16. Nach der Ligation durchführen DNA Cleanup mit bevorzugten, im Handel erhältlich Silicagel-Membran reinigen Kit. Signifikanten Verlust der DNA auftreten folgenden Ligationsreaktion, eine ungefähre 30-50% Verlust der DNA. Überprüfen Religation von auf 1% Agarose Gel DNA läuft bei 100 V für 45 min und Beurteilung Konzentration re-ligiert Plasmide (Figur 4D).
  17. Transfektion von methylierten oder unmethylierten Plasmide in D54-Zellen unter Verwendung eines kommerziellen Transfektionsreagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. Samen D54 Zellen auf 12-Well-Platte mit einer 0,14 x 10 6 Zellen / Vertiefung.
  18. Nach 24 Stunden, Transfektion von Zellen, with gleiche Konzentrationen von entweder (1) Nicht methyated CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor oder (2) methylierte CpG-luc2 Plasmid + Renilla oder andere Steuer Luciferase-Vektor.
  19. Zulassen-Zellen für 24 Stunden Transfektion vor der Durchführung Dual Luciferase-Assay. Führen Sie Test gemäß Herstellerangaben. Führen Sie Messwerte unter Verwendung eines Luminometers. Lesen Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung.
  20. Berechnen Verhältnis von Firefly Luziferase-Aktivität zu Renilla oder andere Steuer Luciferase-Aktivität. Normalisieren methylierte Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität, um nicht methylierten Firefly: Steuer Luciferase-Aktivität durch Division methylierte Luciferase-Aktivität von nicht methylierten Luciferaseaktivität

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Ergebnisse

Eine angereicherte Population von Astrozyten wurde mittels FACS-Sortierung von eGFP-S100β transgenen Tieren 27 erworben. Aufgrund abnehmender Qualität der Zellen und molekularen Moleküle von Tieren, die älter sind als postnatalen Tag 50 (p50) isoliert, alten Tieren p0-p40 sind optimal für solche Experimente. Cortexgewebe wurde für diese Experimente verwendet. Cortices von zwei bis sechs Tiere wurden gepoolt. FACS wurde UAB Umfassende Durchflusszytometrie Core Facility durchgeführt. Sortier wurde am Bec...

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Diskussion

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

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Offenlegungen

The authors have no disclosures.

Danksagungen

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

Referenzen

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