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요약

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

초록

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

서문

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

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프로토콜

모든 동물은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 처리되었다. 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 관리 및 사용위원회는 동물의 사용을 승인했다.

1. 전체 뇌 조직에서 성상 (FACS)을 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 풍부한 성상 세포 인구에서 RNA와 DNA를 얻기

  1. 1 분 동안 이산화탄소 후 빠르게 목을 벨과 진정 동물. 앨버 커키 등의 알에 설명 된대로 피질을 해부, 26.; 그것은 수막을 제거 할 필요가 없다.
    참고 :. S100β에서 eGFP는 (성상 세포 마커) 프로모터를 발현하는 형질 전환 쥐 이타 쿠라 등 (27)에 의해 생성 및 성상 세포의 FACS 정렬을 위해 사용되었다.
  2. 제조사의 프로토콜에 따라 비 멸균 조건 하에서 파파인 해리 키트를 사용하여 전체 뇌 균질 물을 준비한다. 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃에서 파파인을 열 활성화합니다. 노트 :파파인 솔루션은 제조업체에서 제공 및 L 시스테인 및 EDTA를 (재료의 표 참조)이 포함된다.
    1. 절단 또는 튜브는 95 % O 2 반송하도록 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 구멍을 드레 멜 : 5 % CO 2는 폐쇄 원추형 튜브에 공급되는 (도 1a 참조). 해리 미디어 함유 10mm 배양 접시에 해부 피질 배치 (하여 20 mM 글루코스 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (500 U / ml)로 보충 된 95 %의 O를 평형화 MEM을 2 : 5 % CO 2) (1)에 조직을 말하다 깨끗한 면도날을 사용 X 1mm 2 개.
  3. 파파인 함유 용액 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 10 ㎖를 사용하여 수동 pipetman 전사 조직. 조직이 이월 해리 미디어의 양을 최소화하기 위해 배출 전에 전송 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 95 % O 2로 평형화 파파인 용액을 보관 : 5 % CO 2 항온 처리 기간 동안 표면을 통하여 가스 교환. 하지 거품 파파인 soluti를 수행에. 37 ° C의 물을 욕조에 20 분 동안 조직을 품어.
  4. 파파인 솔루션에 다음과 배양, 씹다 조직 느린 속도로 10 ml의 전송 피펫으로 10 배. 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 흐린 세포 현탁액.
    1. 표면을 통한 가스 교환 (제조사에 의해 제공된)의 DNase / 억제제 알부민 용액과 평형의 DNase / 억제제 알부민 용액 3 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 제조업체의 지침에 따라 상업 불연속 밀도 기울기를 준비합니다.
  5. 6 분 동안 1,000 XG 불연속 밀도 구배 스핀. 피펫을 사용하여 바닥 펠렛을 흡입에 의해 튜브의 바닥에서 해리 세포를 분리.
  6. 0.02 % 소 혈청 알부민 및 1 ㎎ / ㎖의 DNase 또는 배양 배지 HEPES 완충 바람직 DPBS로 2-3 ml 중에 해리 된 세포를 다시 일시 중지. FACS (그림 2A) 전에 40 μm의 필터를 통해 전달합니다. 정렬 될 때까지 얼음 세포를 유지합니다.
    1. 외과 (28)를 수행합니다.
    2. 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛 세포.
      주 : 펠릿의 성상은 즉시 사용 또는 DNA 추출까지 -80 ° C에 보관 될 수있다.
  7. RNA와 DNA를 선호하는 분리 방법 (29) (30)를 사용하여 압축을 풉니 다. 분광 광도계와 bioanalyzer (31)를 통해 RNA 및 DNA 농도와 품질을 평가합니다.
    주의 : 후속 단계에서 단지 고품질 RNA 및 DNA를 활용하여 각각 280분의 260 = 2.0~2.2 및 1.8-1.9를. Bioanalyzer 분석은 RNA 분해 또는 DNA 파편에 대해 평가하는 것이 필수적이다. RNA 또는 DNA는 즉시 사용하거나 또는 -20 ° C, 각각 후속 연구를위한 C °에서 -80 저장할 수 있습니다.

2. 메틸화에 민감한 고해상도 용융 분석 (MS-르마)를 사용하여 유전자의 DNA 메틸화 상태를 평가

  1. 유전자에 어떤의 CpG 섬을 식별하는 것이 바람직 온라인 메틸화 매핑 소프트웨어에 관심의 유전자 서열을 입력관심 (32).
    1. 중아 대해 디자인 된 프라이머는 DNA 서열 (33)를 변환하여 제조사의 프로토콜에 따라 바람직한 DNA 중합 효소를 이용하여 증폭한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤을 실행하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. -20 ° C에서 20 μM의 재고 농도 스토어 프라이머.
  2. 중아는 같은 동물 종 (34)로부터 0~100%에 이르기까지 각각의 샘플과 메틸화 된 DNA 표준 DNA의 500 ~ 1,000 NG를 변환합니다. 용출 시료 20 NG / μL의 농도를 제공한다. 분광 광도계 (31)를 통해 중아 변환 된 DNA의 농도를 확인합니다.
  3. 표 1 및 2에 따른 5 μM 농도에서 바람직한 DNA 폴리머 라제 및 프라이머를 사용하여 MS-HRM 증폭 용 셋업 20 μL 반응. 중으로, FACS의 DNA 메틸화 및 표준을 포함하여 모든 샘플을 실행할.
  4. 분석 소프트웨어에 따라, 미리 설정하고 시작 매개 변수를 중지 포스트용융 곡선의 천이 주위. 세트 미리 용융 개시 및 둘 사이의 차이가 0.​​2 정도로 미리 용융 정지 파라미터 - 0.5 ° C. 후 용융 시작 및 사후 용융 유사 중지를 설정합니다. 각 샘플에 대한 피크 온도 차이 데이터의 압축을 풉니 다.
  5. 메틸화 백분율 기준 (Y 값)과 대응하는 평균 피크 온도차 (x 값)을 사용하여 선형 회귀 방정식 (도 3A-B, 표 3-4)을 생성한다. 미지 시료 (35)의 메틸화 상태를 추정하기 위해 선형 회귀 방정식을 사용합니다.

3. 루시퍼 라제 분석의 사용을 통해 하이퍼 메틸화 발기인 활동 평가

  1. 표적 유전자 (2.1 단계)의의 CpG 섬을 식별합니다. 이 PCR의 CpG 섬 luc2-37 플라스미드를 제조 luc2 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자의 상류에 관심 36 클론의 영역을 증폭.
  2. 제한을 통해의 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 30 μg의 선형화효소 소화 38. 제한 다이제스트에 대한 사이트를 확인하고 원하는 커터 소프트웨어 (38)를 사용하여 두 번 상처를 피할 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화를 다음과 같은 적절한 온도와 시간에 효소를 열 - 불 활성화. DNA의 최소 손실은 선형화 단계에서 발생합니다.
  3. 30 ° C에서의 CpG 메틸화 (M.Sssl) O / N을 사용하거나 다음과 같은 조정을 제외하고 처리되지 않은 다음과 같은 제조 업체 프로토콜을 남겨 메틸화 선형화 플라스미드.
  4. 50 μL 반응을 수행합니다.
  5. 선형화 플라스미드 700 NG 메틸화에의 CpG 메틸화의 5 단위를 사용합니다.
  6. 13 ~ 19 시간 동안 반응 O / N을 실행합니다.
  7. 의 CpG 메틸화 반응에 따라, 시판되는 실리카 - 겔 막의 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 정리 표준을 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 메틸화 된 CpG 반응 30-60 %의 감소에 따라 발생한다.
  8. HPA II 제한 다이제스트를 통해 플라스미드의 메틸화를 확인합니다.
  9. 메틸화 또는 비 메틸화 된 DNA 1 μg의를 가지고 제한은 37 ℃에서 1 시간 동안 HPA II 다이제스트. 각 μg의 DNA를 위해 HPA II의 5 ~ 10 단위를 사용합니다. HPA II 소화에 따라, 선호, 시판되는 실리카 - 겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. 시각화를위한 45 분 (그림 4B) 100 V에서 TAE 나 TBE 버퍼에 1 % 아가 로스 DNA 젤에 모두의 CpG 메틸화 및 비 메틸화 된 플라스미드를 실행합니다.
  10. 적절한 제한 효소와 더블 소화에 따라 모두 메틸화 및 비 메틸화 플라스미드는 전체 길이 루크 2 (벡터)과의 CpG 섬 (삽입) 38 조각을 분리합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화 다음 적절한 온도와 열을 비활성화 효소에서 더블 소화 O / N을 수행합니다. DNA 농도의 손실을 최소화 이중 제한 다이제스트 동안 발생합니다.
  11. O를 분리 할 수​​ 있도록 1 시간 동안 100 V에서 1 %의 DNA 아가 로스 젤을 두 번 소화 플라스미드를 실행F 벡터 삽입 (그림 4C). 주의. 보호 자외선 얼굴 가리개를 착용, 밴드를 시각화 탁상 블랙 라이트에 DNA 젤을 배치합니다. 깨끗한 수술 블레이드를 사용하여 크기, 소비세 메틸화 및 비 메틸화 삽입 및 비 메틸화 된 벡터 기준으로합니다.
  12. 포화 페놀, pH가 6.6을 사용하여 젤 추출 DNA. 간단히, 벡터 또는 삽입을 포함하는 DNA 젤 무게. DNA 젤 0.1 g 당 페놀의 100 μl를 사용합니다. 유리 다운스 균질 기에서 페놀을 사용하여 DNA 겔 균질화.
  13. 클로로포름 (페놀 량의 1/5 사용)을 추가하고 20 초 동안 샘플을 흔들. 2 ~ 3 분 동안 실온에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 최대 속도 (16.1 X 1,000 XG)에서 15 분 동안 원심 분리기.
  14. 수용액을 제거하고, 3 M 아세트산 나트륨 및 에탄올 2.5 배 부피의 0.1X 볼륨. -80 ° C에서 1 시간 동안 샘플을 품어. 인큐베이션 후, 에탄올을 제거하고 바람직한 완충액 30 μL에 DNA를 다시 일시. DNA의 상당한 손실이 삽입 및 벡터의 다음 분리를 발생, 30 % ~ 50 % 싸다SS.
  15. 재 결찰을 메틸화 및 비 메틸화 된 인서트 T4 DNA 리가 제 (38)를 이용하여 벡터를 비 메틸화. 결찰 반응에 삽입하는 벡터의 4 비율 : 1을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 설치 반응. 반응 50 μL의 총 부피를 사용하여 C ° 또는 얼음 양동이 위에 뚜껑 얼음에 -20 O / N을 품어.
  16. 결찰 후, 선호, 시중에서 판매하는 실리카겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 연결 반응, DNA의 대략 30 % ~ 50 %의 손실에 따라 발생한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤에 실행하여 재 결찰을 확인하고 재 결찰 플라스미드 (그림 4D)의 농도를 평가합니다.
  17. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 형질 전환 시약을 이용하여 세포 내로 D54 메틸화 또는 비 메틸화 된 플라스미드를 형질 감염. 잘 0.14 × 10 6 세포 / 12 웰 판에 씨앗 D54 셀.
  18. 24 시간 후, 형질 세포 위스콘신(1) 비 methyated의 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 또는 (2) 메틸화 된 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 중 하나의 일 동일 농도.
  19. 세포가 듀얼 루시 페라 제 분석을 수행하기 전에 24 시간 동안 형질을 허용합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다. 루미를 사용하여 측정을 수행합니다. 세중에서 잘 각을 읽어보십시오.
  20. 레 닐라하는 반딧불 루시 페라 제 활동의 비율 또는 기타 제어 루시퍼 라제 활성을 계산합니다. 비 메틸화를 제어 반딧불 루시페라아제 활성 : 메틸화 반딧불 정상화 제어 루시퍼 라제 활성을 비 메틸화 된 루시퍼 라제 활성에 의해 메틸화 된 루시퍼 라제 활성을 나누어

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결과

성상 세포의 풍부한 인구는 eGFP는-S100β 형질 전환 동물 (27)의 FACS 정렬을 통해 인수되었다. 때문에 P0-P40 세 세포와 출생 후 하루 50 (P50)보다 오래된 동물에서 분리 된 분자 분자, 동물의 품질을 감소 그러한 실험에 최적이다. 대뇌 피질 조직을 다음 실험에 사용 하였다. 2-6 동물의 피질 함께 모았다. FACS는 UAB 종합 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 수행되었다. 정렬은 벡톤 디킨슨 (Becton Dickins...

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토론

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

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공개

The authors have no disclosures.

감사의 말

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

참고문헌

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