JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Özet

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Giriş

Epigenetics is the study of chemical modifications that can affect the transcriptional activity of the genome. Essentially, without a change in the DNA sequence, epigenetic modifications such as DNA methylation, histone acetylation, and histone methylation are sufficient to reversibly alter patterns of gene expression 1. DNA methylation, a potent regulator of gene expression, is the most well characterized epigenetic modification. DNA methylation is the covalent attachment of methyl groups on the C5 position of a cytosine, typically the cytosine of a cytosine-guanine dinucleotide, also known as a CpG site. Areas that contain a high density of CpG sites are known as CpG islands (CGIs). CGIs are frequently associated with transcriptional start sites (TSS) and gene promoters 1-3. Thus, while changes in DNA methylation at CGIs are not always concomitant with changes in cellular expression or function, changes in DNA methylation at CGIs can exert powerful regulation on transcriptional activity 2.

Historically, DNA methylation was observed to be essential in embryogenesis, imprinting, and development, with little changes in the levels of DNA methylation occurring in post-mitotic cells (with the exception of alterations in cancer-related genes) 4,5. However, the field of neuroepigenetics has highlighted an important non-developmental role for DNA methylation. Specifically, cognitive epigenetics has redefined DNA methylation as a highly plastic mechanism integral in mediating both the transcriptional activation and repression of genes essential for the process of learning and memory 6. Apart from cognitive epigenetics, studies modeling ischemic injury and neuropathic pain characterize DNA methylation as a labile mechanism that responds rapidly to a variety of CNS insults 7-9. In regards to astrocytes, several lines of evidence suggest DNA methylation plays an important role in astrogliogenesis. Fan et al., found that conditional KO of DNMT1 in neural progenitor cells (NPCs) resulted in precocious development of astrocytes concordant with a global state of hypomethylation 10. Additionally, Perisic et al., concluded differential levels of DNA methylation of the GLT-1 promoter mediated differential levels of expression of the glutamate transporter in the cortex and cerebellum, emphasizing a role in DNA methylation in establishing brain-region specific patterns of astrocytic gene expression 11. Overall, numerous studies underscore the dynamic and labile nature of DNA methylation in the CNS as environment, drugs, and injury have all been shown to change DNA methylation and often, gene expression 4,9. Together, these neuroepigenetic studies point to DNA methylation as a feasible therapeutic target with the potential to mitigate a variety of CNS pathologies.

As the field of epigenetics expands its understanding of the role of DNA methylation in neurodevelopment and disease, the challenge of moving DNA methylation towards a therapeutic target is performing not only correlative, but causative studies that define specific gene targets and sites. Additionally, surveying changes in DNA methylation specific to brain region and cell type remains an ongoing and time worthy challenge unique to the field of neuroepigenetics. This protocol utilizes a variety of techniques including fluorescence-activated cell sorting (FACS) of astrocytes, methylation-sensitive high resolution melt analysis (MS-HRM), and a methylation luciferase assay to investigate the DNA methylation status of KCNJ10, a gene that encodes for Kir4.1. Kir4.1 is a glial specific potassium channel that demonstrates both brain region and cell specific patterns of expression in the CNS 12-16. Kir4.1 expression increases moving from rostral to caudal CNS regions, with the highest expression occurring in the spinal cord 15. Although the channel is expressed in ependymal cells, oligodendrocytes and their precursor cells, Kir4.1 is predominantly expressed in astrocytes and thought to be essential for maintaining homeostatic levels of potassium as well as supporting glutamate uptake by setting the astrocytic resting membrane potential at a hyperpolarized -80mV 12,16-19. Importantly, the expression of Kir4.1 is non-static both during development and following multiple forms of CNS injury 20-25. We wished to examine the epigenetic regulation of this channel, specifically in astrocytes during development. The techniques utilized offer gene-specific and targeted CpG site analyses that provide causal evidence for a role of DNA methylation in regulating KCNJ10 gene expression. These techniques can be applied to other genes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvanlar Sağlık kurallar National Institutes uyarınca ele alındı. Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hayvan kullanımını onayladı.

1. Tüm Beyin Dokusu gelen Astrositler (FACS) Sıralama Floresan Aktif Hücre kullanarak Zenginleştirilmiş Astrositik Populasyonundan RNA ve DNA elde edilmesi

  1. 1 dakika boyunca CO2 ve daha sonra hızlı bir decapitate ile oturaklı bir hayvan. Albuquerque ve diğerleri içinde tarif edilen korteks teşrih 26.; Bu meninksleri kaldırmak için gerekli değildir.
    Not:. S100β altında eGFP (bir astrosit belirteci) promotör ifade transgenik fareler Itakura ve ark 27 tarafından üretilen ve astrositlerde FACS sıralama için kullanılmıştır.
  2. Üreticinin protokolüne göre, steril olmayan koşullarda papain ayrılma kiti kullanılarak tüm beyin homojenatı hazırlayın. 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C 'de papain ısı aktive eder. Not:Papain çözüm üretici tarafından sağlanan ve L-sistein ve EDTA (Malzeme Tablo bakınız) içerir.
    1. Kesme veya boru 95,% O 2 taşıyan izin vermek için bir 50 mL konik tüp tepesi içine bir delik dremel:% 5 CO2 kapalı bir konik tüp içine beslenmeleri için (Şekil 1A). Ayrışma ortamı içeren 10 mm kültür kaplarına parçalara korteksleri yerleştirin (20 mM glikoz ve penisilin / streptomisin (500 U / ml) ile desteklenmiş ve% 95 O dengelenmiş MEM 2:% 5 CO2) ve 1 içine dokusunu inceltmek için temiz bir traş makinesi bıçak kullanımı x 1 mm 2 adettir.
  3. Papain çözeltisi içeren 50 ml konik tüp 10 ml manuel pipetman kullanarak doku transferi. Doku taşınan ayrışma ortamı miktarını en aza indirmek için boşaltmadan önce transfer pipeti altına yerleşmek için izin verin. % 95 O 2 dengelenmiş papain çözüm tutun:% 5 CO 2 inkübasyon süresi boyunca yüzey gaz alışverişi yoluyla. Değil kabarcık papain soluti yapınüzerinde. 37 ° C su banyosu içinde 20 dakika boyunca doku inkübe edin.
  4. Papain çözeltisi içinde İnkübasyonun ardından, çiğnemek dokusu yavaş bir hızda 10 ml transfer pipetle 10 kere. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin parçalı hücre süspansiyonu.
    1. Yüzey gaz değişimi ile (üretici tarafından sağlanan) DNase / albümin önleyicisi çözüm dengelenmesi ve DNaz / albümin, inhibitör çözeltisinin 3 ml pelet hücrelerin yeniden askıya. Üretici talimatları izleyerek ticari kesintili yoğunluk gradiyenti hazırlayın.
  5. 6 dakika boyunca 1.000 xg'de kesintili yoğunluk gradiyenti Spin. Bir pipet kullanılarak taban pelet emme tüpün tabanından ayrışmış hücrelerin izole edin.
  6. % 0.02 sığır serumu albümini ve 1 mg / ml DNase ve kültür ortamı tamponlu tercih HEPES DPBS 2-3 ml ayrışmış hücrelerin askıya Re. FACS (Şekil 2A) önce 40 um'lik bir filtreden geçirin. Sıralama kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
    1. FACS 28 gerçekleştirin.
    2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de 1,5 ml santrifüj tüplerine Pelet hücreleri.
      Not: Topak haline getirilen astrositler derhal kullanılan veya DNA ekstraksiyon kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
  7. RNA ve DNA izolasyon yöntemi tercih 29 30 kullanarak ayıklayın. Spektrofotometre ve Bioanalyzer 31 üzerinden RNA ve DNA konsantrasyonu ve kalitesini değerlendirmek.
    Not: sonraki adımlarda sadece yüksek kaliteli RNA ve DNA yararlanın, sırasıyla 260/280 = 2.0-2.2 ve 1.8-1.9. Bioanalyzer analizi RNA veya bozunma kaynaklı DNA fragmantasyonu için değerlendirilmesi esastır. RNA veya DNA, hemen kullanılabilir da -20 ° C, sırasıyla, daha sonraki çalışmalar için C ° -80 saklanabilir.

2. Metilasyona duyarlı Yüksek Çözünürlüklü eritin Analizi (MS-HRMA sayesinde) kullanarak bir Genin DNA Metilasyonu Durumu değerlendirilmesi

  1. Geninin herhangi bir CpG adaları tespit edilmesi tercih çevrimiçi metilasyon haritalama yazılımı içine ilgi konusu genin dizisinin girinilgi 32.
    1. Bisülfit karşı tasarımı Primerler DNA dizisini 33 dönüştürülür ve üreticinin protokolüne uygun olarak tercih edilen bir DNA polimerazı kullanılarak amplifiye. 45 dakika boyunca 100 V'de bir% 1 agaroz jeli bir DNA çalıştırarak güçlendirilmiş ürün boyutu kontrol edin. -20 ° C'de 20 uM stok konsantrasyonu mağazası primerler.
  2. Bisülfit aynı hayvan türlerinin 34 0-100% arasında değişen, her numune ve metillenmiş DNA standartları DNA 500-1000 ng dönüştürün. Elute numuneler 20 ng / ul konsantrasyon elde edildi. Spektrofotometre 31 üzerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA'nın konsantrasyonu doğrulayın.
  3. Tablo 1 ve 2'ye göre 5 uM konsantrasyonda tercih edilen bir DNA polimeraz ve primerler kullanılarak MS-İK amplifikasyonu için kurulum 20 ul reaksiyonlar., Üç kez FACS DNA ve metillenmiş standartlar dahil olmak üzere, tüm örnekler, çalıştırın.
  4. Analiz yazılımına bağlı olarak, önceden ayarlanmış ve başlangıç ​​ve parametreleri durdurmak sonrasıeriyik eğrisinin geçişleri etrafında. Set önceden eriyik başlangıç ​​ve ikisi arasındaki fark 0,2 yani pre-eritme durdurma parametreleri - 0.5 ° C. Post-eriyik başlangıç ​​ve post-eriyiği benzer durdurmak ayarlayın. Her numune için pik sıcaklık farkı verileri ayıklayın.
  5. Yüzde metilatlı standartları (y-değer) ve bunlara karşılık gelen ortalama pik sıcaklık farkları (x değeri) kullanarak lineer regresyon denklemini (Şekil 3A-B, Tablo 3-4) üretir. Bilinmeyen numunelerin 35 metilasyon durumunu tahmin etmek için bu lineer regresyon denklemini kullanın.

3. Lusiferaz Testi Kullanımı yoluyla Hyper-metillenmiş Promoter Etkinliği değerlendirilmesi

  1. Hedef genin (Adım 2.1) CpG adaları tanımlayın. PCR CpG-ada-luc2 plazmidler 37 üretmek için luc2 ateş böceği lusiferaz raportör geninin yukan çıkar 36 ve klon bölgelerin yükseltilmesi.
  2. Kısıtlaması ile CpG-ada-luc2 plazmidin 30 ug Linearizeenzim sindirimi 38. Kısıtlama sindirmek için siteleri doğrulayın ve tercih edilen kesici yazılımı 38 kullanılarak çift keser kaçının. Üreticinin protokolüne uygun olarak sindirimi takiben uygun sıcaklık ve sürede enzimleri ısı etkisiz hale getirirler. DNA Minimal kaybı doğrusallaştırma adımı sırasında oluşur.
  3. 30 ° C 'de CpG metilaz (M.Sssl) O / N ile veya aşağıdaki ayarlamalar haricinde işlenmemiş aşağıdaki üretici protokolü terk metilat linearize plazmidler.
  4. 50 ul reaksiyonları gerçekleştirin.
  5. Lineerleştirilmiş plazmid 700 ng metillenmesi için CpG metilaz 5 birimlerini kullanın.
  6. 13-19 saat boyunca tepkileri O / N çalıştırın.
  7. CpG metilaz reaksiyonundan sonra, ticari olarak temin edilebilen silis jel membran üreticinin protokolüne uygun kit temizlemek standardı kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli kayıplar CpG metilaz reaksiyonu,% 30-60 kaybı takiben ortaya çıkar.
  8. Bir Hpa II kısıtlama sindirmek yoluyla Plazmidlerin metilasyon doğrulayın.
  9. Metillenmiş ya da olmayan metillenmiş DNA 1 ug al ve sınırlama, 37 ° C'de 1 saat boyunca Hpa II ile sindirmek. Her ug DNA için Hpa II 5-10 birimlerini kullanın. Hpa II sindirim ardından, tercih, ticari olarak mevcut silis jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. Görselleştirme için 45 dakika (Şekil 4B) süreyle, 100 V TAE veya çin TBE tamponu içinde bir% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA hem de CpG metile olmayan metillenmiş plazmidler çalıştırın.
  10. Uygun kısıtlayıcı enzimlerle çift sindirim Konu hem metil ve metillenmemiş plazmidler tam uzunlukta luc 2 (vektör) ve CpG ada (insert) 38 fragmanları serbest bırakmak için. Üreticinin protokolüne uygun olarak yumuşatıldıktan sonra uygun sıcaklık ve ısı etkisizleştirilmiş enzimler çift sindirim O / N gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu minimum kayıp çift kısıtlama sindirmek sırasında oluşur.
  11. O ayrılması için izin vermek için 1 saat boyunca 100 V'ta% 1 DNA agaroz jeli üzerinde iki sindirilmiş plazmidler başlatf vektörü ve takın (Şekil 4C). Dikkat. Koruyucu UV yüz siperi giyen, bantları görselleştirmek için bir masa siyah ışık DNA jel yerleştirin. Temiz cerrahi bıçak kullanarak boyutu, tüketim metile ve non-metile insert ve non-metile vektörü dayanarak.
  12. Doymuş fenol, pH'ı 6.6 kullanılarak jel ekstresi, DNA. Kısaca, vektör ve inserti ihtiva eden bir DNA jel tartın. DNA jel 0,1 gramı başına fenol 100 ul kullanabilir. Cam Dounce homojenleştirici kullanılarak fenol DNA jel homojenize edilir.
  13. Kloroform (fenol hacminin 1/5 kullanarak) ekleyin ve 20 saniye boyunca numune sallayın. 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4 ° C'de maksimum hızda (16.1 x 1000 xg) 15 dakika boyunca santrifüj.
  14. Sulu çözeltinin çıkarın ve 3 M sodyum asetat ve etanol 2.5X hacminin 0.1x hacmi ekleyin. -80 ° C'de 1 saat süre ile inkübe edin. Bir kuluçkaya yatırmayı takiben, etanolü ortadan kaldırmak ve tercih edilen tampon 30 ul DNA yeniden askıya. DNA'nın önemli bir kayıp ekler ve vektörlerin aşağıdaki izolasyonunu oluşur% 30-50 loss.
  15. Yeniden bağlanması için metile olmayan metillenmiş uçlar T4 DNA ligazı kullanılarak 38 vektörü metillenmemiş. Ligasyon reaksiyonları için eklemek için vektörün 4 oranında bir 1: kullanın. Üretici talimatlarına göre Kurulum tepki. Reaksiyonları için 50 ul bir toplam hacim kullanma ve C ° veya buz kovası fazla kapaklı buz üzerinde -20 ° C'de O / N inkübe edin.
  16. Bağlanmasından sonra, tercih edilen, piyasada mevcut silika-jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli bir kayıp ligasyonu reaksiyonu, DNA'nın yaklaşık% 30-50 kaybı takiben ortaya çıkar. 45 dakika boyunca 100 V'ta% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA çalıştırarak yeniden ligasyonu doğrulamak ve yeniden lige plazmidler (Şekil 4D) konsantrasyonunu değerlendirmek.
  17. Imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak D54 hücreleri içine metile veya non-metillenmiş plazmidler transfekte. De bir 0.14 x 10 6 hücre / 12-yuvalı bir plaka uzerinde Tohum D54 hücreleri.
  18. 24 saat sonra, transfekte hücreler, wi(1) non-methyated CpG luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da (2), metile edilmemiş CpG-luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da inci eşit konsantrasyonlarda.
  19. Hücreler Çift Lusiferaz analiz yapılmadan önce 24 saat boyunca transfekte izin verin. Üretici talimatlarına göre tahlil gerçekleştirin. Bir luminometre kullanılarak okuma gerçekleştirin. Üç kopya halinde her bir okuyun.
  20. Renilla Firefly lusiferaz aktivitesinin oranının veya başka bir kontrol lusiferaz aktivitesi hesaplayın. Metillenmemiş Firefly kontrol lusiferaz aktivitesi: metillenmiş Firefly normalize kontrol lusiferaz aktivitesi olmayan metile lusiferaz aktivitesi ile metile lusiferaz aktivitesi bölünmesiyle

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Astrositlerde zenginleştirilmiş nüfus eGFP-S100β transgenik hayvanların 27 FACS sıralama yoluyla satın alındı. Nedeniyle p0-p40 yaşlı hücrelerin ve doğum sonrası gün 50 (p50) 'den daha büyük hayvanlardan izole edilen molekül moleküllerin, hayvanlar kalitesini düşüren bu tür deneyler için en uygun olan. Kortikal dokusu Bu deneyler için kullanılmıştır. Iki ila altı hayvandan korteks birlikte havuzlandı. FACS UAB Kapsamlı Sitometrisi Çekirdek tesisinde gerçekleştirildi. Sı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

This protocol describes the isolation of an enriched population of astrocytes via FACS as well as a variety of techniques that allow for both correlative and causative studies between DNA methylation and gene expression. These techniques, used in isolation or in combination, are particularly useful for laboratories that work with tissue of high cellular heterogeneity or are interested in the DNA methylation status of a particular gene or gene region versus global DNA methylation changes. One relatively unique challenge i...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have no disclosures.

Teşekkürler

This work was supported by R01NS075062-01A1. FACS sorting performed at UAB Comprehensive Flow Cytometry Core facility (P30 AR048311, P30 A1027767). Dr. Scott Philips from the UAB Neurobiology Core facility and Dr. Susan Nozell from UAB CDIB assisted with technical aspects of the luciferase assay.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen80204
Methyl PrimerApplied Biosystemsonlinesoftware to localize CpG Islands
EZ DNA methylation KitZymo ResearchD5001
Rat Premixed Calibration StandardEpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704Used for gel extraction and DNA cleanup
Restriction enzymesNew England BioLabs
NEB cutterNew England BioLabsonlineverify restriction digest sites
Dual Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
Luc2 vector, pGL4.10PromegaE6651
renilla vector, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX and Plus ReagentLife TechnologiesA12621
Phenol, saturated pH 6.6/6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000/2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesonline
AB High Resolution Melting Getting Started Guide Life Technologiesonline
AB 7900HT Fast Real-Time SystemLife Technologies

Referanslar

  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler BiyolojiSay 103DNA metilasyonuMS HRMA sayesindeLusiferaz promot r deneyiFACSAstrositlerKir4 1KCNJ10

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır